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微生物腐食 (MIC) は、多大な経済的損失につながる可能性があるため、多くの業界で深刻な問題となっています。スーパー二相ステンレス鋼 2707 (2707 HDSS) は、耐薬品性に​​優れているため、海洋環境で使用されています。ただし、MIC に対する耐性は実験的に実証されていません。この研究では、海洋好気性細菌である緑膿菌によって引き起こされる MIC 2707 HDSS の挙動を調べました。電気化学分析は、2216E 培地に緑膿菌バイオフィルムが存在すると、腐食電位の正の変化と腐食電流密度の増加が起こることを示しました。X 線光電子分光法 (XPS) の分析は、バイオ フィルムの下のサンプルの表面に Cr 含有量の減少を示した。ピットの視覚的分析は、緑膿菌バイオ フィルムが 14 日間のインキュベーション中に 0.69 μm の最大ピット深さを生成したことを示しました。これは小さいですが、2707 HDSS が緑膿菌バイオ フィルムの MIC に対して完全に免疫があるわけではないことを示しています。
二相ステンレス鋼 (DSS) は、優れた機械的特性と耐食性の完璧な組み合わせにより、さまざまな産業で広く使用されています1,2。ただし、局所的な孔食は依然として発生し、この鋼の完全性に影響を与えます3,4。DSS は微生物腐食 (MIC)5,6 に対して耐性がありません。DSS の幅広い用途にもかかわらず、DSS の耐食性が長期間の使用に十分でない環境が依然として存在します。これは、より高い耐食性を備えたより高価な材料が必要であることを意味します。Jeon ら 7 は、スーパー二相ステンレス鋼 (SDSS) でさえ、耐食性に関していくつかの制限があることを発見しました。そのため、場合によっては、より耐食性の高いスーパー二相ステンレス鋼（HDSS）が必要になります。これにより、高合金 HDSS が開発されました。
耐腐食性 DSS は、アルファ相とガンマ相の比率に依存し、第 2 相に隣接する Cr、Mo、および W 領域 8、9、10 で枯渇します。HDSS は Cr、Mo、N11 の含有量が多いため、耐食性に優れ、wt.% Cr + 3.3 (wt.% Mo + 0.5 重量%W) + 16% 重量N12.その優れた耐食性は、約 50% のフェライト (α) 相と 50% のオーステナイト (γ) 相を含むバランスのとれた組成に依存します。HDSS は、より優れた機械的特性と塩化物腐食に対する高い耐性を備えています。改善された耐食性により、海洋環境などのより攻撃的な塩化物環境での HDSS の使用が拡大されます。
MIC は、石油、ガス、水道産業などの多くの産業で大きな問題となっています14。MIC は全腐食損傷の 20% を占めます15。MIC は、多くの環境で観察できる生物電気化学的腐食です。金属表面に形成されるバイオフィルムは、電気化学的条件を変化させ、それによって腐食プロセスに影響を与えます。MIC 腐食はバイオフィルムが原因であると広く信じられています。電気発生微生物は、生き残るために必要なエネルギーを得るために金属を食べ尽くします17。最近の MIC 研究では、EET (細胞外電子伝達) が起電性微生物によって誘発される MIC の律速因子であることが示されています。張ら。18 は、電子仲介者が Desulfovibrio sessificans 細胞と 304 ステンレス鋼の間の電子の移動を加速し、より深刻な MIC 攻撃をもたらすことを実証しました。アニング等。19およびウェンツラフ等。20 は、腐食性の硫酸塩還元細菌 (SRB) のバイオフィルムが金属基板から電子を直接吸収し、深刻な孔食を引き起こすことを示しています。
DSS は、SRB、鉄還元菌 (IRB) などを含む培地で MIC の影響を受けやすいことが知られています 21 。これらの細菌は、バイオ フィルム下の DSS の表面に局所的な孔食を引き起こします22,23。DSS とは異なり、HDSS24 MIC はあまり知られていません。
緑膿菌は、自然界に広く分布するグラム陰性の運動性の桿菌です25。緑膿菌も海洋環境における主要な微生物群であり、MIC 濃度の上昇を引き起こします。シュードモナスは腐食プロセスに積極的に関与しており、バイオフィルム形成中の先駆的な植民者として認識されています。マハット等。28および元ら。29 は、緑膿菌が水生環境における軟鋼および合金の腐食速度を増加させる傾向があることを実証しました。
この作業の主な目的は、電気化学的方法、表面分析方法、および腐食生成物分析を使用して、海洋好気性細菌緑膿菌によって引き起こされる MIC 2707 HDSS の特性を調査することでした。開回路電位 (OCP)、線形分極抵抗 (LPR)、電気化学インピーダンス分光法 (EIS)、潜在的な動的分極などの電気化学的研究を実施して、MIC 2707 HDSS の動作を研究しました。エネルギー分散型分光分析 (EDS) を実行して、腐食した表面の化学元素を検出しました。さらに、X 線光電子分光法 (XPS) を使用して、緑膿菌を含む海洋環境の影響下での酸化膜不動態化の安定性を判断しました。ピットの深さは、共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）で測定されました。
表 1 に 2707 HDSS の化学組成を示します。表 2 は、2707 HDSS が 650 MPa の降伏強度を持つ優れた機械的特性を備えていることを示しています。図上。図１は、溶体化熱処理された２７０７ ＨＤＳＳの光学微細構造を示す。約 50% のオーステナイト相と 50% のフェライト相を含む微細構造では、二次相のないオーステナイト相とフェライト相の細長い帯が見られます。
図上。図２ａは、３７℃で１４日間、２２１６Ｅ非生物培地およびＰ．これは、Eocp の最大かつ最も重要な変化が最初の 24 時間以内に発生することを示しています。両方の場合の Eocp 値は、約 16 時間で -145 mV (SCE と比較) でピークに達し、その後急激に低下し、非生物サンプルでは -477 mV (SCE と比較) と -236 mV (SCE と比較) に達しました。Pseudomonas aeruginosa クーポン、それぞれ)。24 時間後、緑膿菌の Eocp 2707 HDSS 値は -228 mV (SCE と比較) で比較的安定していましたが、非生物学的サンプルの対応する値は約 -442 mV (SCE と比較) でした。緑膿菌の存在下での Eocp は非常に低かった。
37 °C での非生物培地および緑膿菌培養液中の 2707 HDSS サンプルの電気化学的研究:
(a) 暴露時間の関数としての Eocp、(b) 14 日目の分極曲線、(c) 暴露時間の関数としての Rp、および (d) 暴露時間の関数としての icor。
表 3 は、14 日間にわたって非生物的および緑膿菌を接種した培地にさらされた 2707 個の HDSS サンプルの電気化学的腐食パラメーターを示しています。アノードとカソードの曲線の接線を外挿して、標準的な方法に従って、腐食電流密度 (icorr)、腐食電位 (Ecorr)、およびターフェル勾配 (βαと βc) を与える交点を得ました30,31。
図に示すように。2b、緑膿菌曲線の上方へのシフトは、非生物的曲線と比較してEcorrの増加をもたらしました。腐食速度に比例する icorr 値は、緑膿菌のサンプルで 0.328 µA cm-2 に増加しました。これは、非生物学的サンプル (0.087 µA cm-2) の 4 倍です。
LPR は、迅速な腐食分析のための古典的な非破壊電気化学的方法です。また、MIC32 の研究にも使用されています。図上。図２ｃは、露出時間の関数としての分極抵抗（Ｒｐ）を示す。Rp 値が高いほど、腐食が少ないことを意味します。最初の 24 時間以内に、Rp 2707 HDSS は、非生物標本では 1955 kΩ cm2、緑膿菌標本では 1429 kΩ cm2 でピークに達しました。図 2c は、Rp 値が 1 日後に急速に減少し、その後 13 日間は比較的変化しないことも示しています。緑膿菌サンプルの Rp 値は約 40 kΩ cm2 であり、非生物学的サンプルの 450 kΩ cm2 値よりもはるかに低くなっています。
icor の値は、均一な腐食速度に比例します。その値は、次の Stern-Giri 方程式から計算できます。
ゾーイらによると。図 33 では、この研究におけるターフェル勾配 B の典型的な値は 26 mV/dec であると見なされました。図 2d は、非生物学的サンプル 2707 の icorr が比較的安定したままであったのに対し、緑膿菌サンプルは最初の 24 時間後に大きく変動したことを示しています。緑膿菌サンプルの icorr 値は、非生物学的対照よりも一桁高かった。この傾向は、分極抵抗の結果と一致しています。
EIS は、腐食した表面での電気化学反応を特徴付けるために使用されるもう 1 つの非破壊的な方法です。非生物的環境および緑膿菌溶液にさらされたサンプルのインピーダンス スペクトルと計算されたキャパシタンス値、サンプル表面に形成されたパッシブ フィルム/バイオ フィルム抵抗 Rb、電荷移動抵抗 Rct、電気二重層容量 Cdl (EDL)、定数 QCPE 位相要素パラメーター(CPE)。これらのパラメーターは、等価回路 (EEC) モデルを使用してデータをフィッティングすることによってさらに分析されました。
図上。図 3 は、非生物培地中の 2707 HDSS サンプルと異なるインキュベーション時間の緑膿菌培養液の典型的なナイキスト線図 (a および b) とボード線図 (a' および b') を示しています。ナイキスト環の直径は、緑膿菌の存在下で減少します。ボード線図 (図 3b') は、総インピーダンスの増加を示しています。緩和時定数に関する情報は、最大位相から取得できます。図上。図４は、単層（ａ）および二重層（ｂ）および対応するＥＥＣに基づく物理的構造を示す。CPE は EEC モデルに導入されます。そのアドミタンスとインピーダンスは次のように表されます。
サンプル 2707 HDSS のインピーダンス スペクトルをフィッティングするための 2 つの物理モデルと対応する等価回路:
ここで、Y0 は KPI 値、j は虚数または (-1)1/2、ω は角周波数、n は 1 未満の KPI パワー インデックスです。電荷移動抵抗反転 (すなわち 1/Rct) は腐食速度に対応します。Rct が小さいほど、腐食速度が高くなります27。14 日間のインキュベーション後、緑膿菌サンプルの Rct は 32 kΩ cm2 に達しました。これは、非生物学的サンプルの 489 kΩ cm2 よりもはるかに小さい値です (表 4)。
図 5 の CLSM 画像と SEM 画像は、7 日後の HDSS サンプル 2707 の表面のバイオフィルム コーティングが密であることを明確に示しています。しかし、14 日後、バイオ フィルムの被覆率は低く、いくつかの死んだ細胞が現れました。表 5は、緑膿菌に 7 日間および 14 日間暴露した後の 2707 HDSS サンプルのバイオフィルムの厚さを示しています。バイオ フィルムの最大厚さは、7 日後の 23.4 μm から 14 日後の 18.9 μm に変化しました。平均バイオ フィルムの厚さもこの傾向を確認しました。7 日後の 22.2 ± 0.7 μm から 14 日後の 17.8 ± 1.0 μm に減少しました。
(a) 7 日の 3-D CLSM 画像、(b) 14 日の 3-D CLSM 画像、(c) 7 日の SEM 画像、(d) 14 日の SEM 画像。
EMF は、緑膿菌に 14 日間さらされたサンプルのバイオフィルムおよび腐食生成物中の化学元素を明らかにしました。図上。図 6 は、バイオ フィルムおよび腐食生成物中の C、N、O、および P の含有量が、純粋な金属よりも大幅に高いことを示しています。これは、これらの元素がバイオ フィルムとその代謝物に関連しているためです。微生物は微量のクロムと鉄しか必要としません。サンプル表面のバイオフィルムおよび腐食生成物中の高レベルの Cr および Fe は、金属マトリックスが腐食により元素を失ったことを示しています。
14 日後、2216E 培地で緑膿菌の有無にかかわらずピットが観察されました。インキュベーション前、サンプルの表面は滑らかで欠陥がありませんでした（図7a）。バイオフィルムと腐食生成物のインキュベーションと除去後、図7bとcに示すように、CLSMを使用してサンプルの表面の最も深いピットを調べました。非生物学的コントロールの表面には明らかな孔食は見られませんでした (最大孔食深さ 0.02 μm)。緑膿菌によって引き起こされる最大ピット深さは、3 つのサンプルからの平均最大ピット深さに基づいて、7 日で 0.52 μm、14 日で 0.69 μm でした (サンプルごとに 10 個の最大ピット深さが選択されました)。それぞれ 0.42 ± 0.12 μm および 0.52 ± 0.15 μm の達成 (表 5)。これらの穴の深さの値は小さいですが重要です。
(a) 暴露前、(b) 非生物的環境で 14 日間、(c) 緑膿菌培養液で 14 日間。
図上。表 8 は、さまざまなサンプル表面の XPS スペクトルを示し、各表面について分析された化学組成は、表 6 にまとめられています。非生物学的対照よりもはるかに低い。(サンプル C および D)。緑膿菌サンプルの場合、Cr 2p 核のレベルでのスペクトル曲線は、574.4、576.6、578.3、および 586.8 eV の結合エネルギー (BE) を持つ 4 つのピーク成分に適合しました。これは、Cr、Cr2O3、CrO3 に起因する可能性があります。 .および Cr(OH)3 である (図 9a および b)。非生物学的サンプルの場合、主要な Cr 2p レベルのスペクトルには、図 1 と 2 の Cr (BE の場合は 573.80 eV) と Cr2O3 (BE の場合は 575.90 eV) の 2 つの主要なピークが含まれます。それぞれ9cとd。非生物サンプルと緑膿菌サンプルの最も顕著な違いは、Cr6+ の存在と、バイオ フィルム下の Cr(OH)3 (BE 586.8 eV) の相対的な割合の高さでした。
2 つの媒体のサンプル 2707 HDSS の表面の広い XPS スペクトルは、それぞれ 7 日と 14 日です。
(a) 緑膿菌への 7 日間の曝露、(b) 緑膿菌への 14 日間の曝露、(c) 非生物的環境での 7 日間、および (d) 非生物的環境での 14 日間。
HDSS は、ほとんどの環境で高レベルの耐食性を示します。Kim ら 2 は、HDSS UNS S32707 が 45 を超える PREN を持つ高度に合金化された DSS であると特定されたことを報告しました。この研究におけるサンプル 2707 HDSS の PREN 値は 49 でした。酸性環境で有用なモリブデンとニッケル。塩化物含有量の高い環境。さらに、バランスの取れた組成と欠陥のない微細構造は、構造安定性と耐食性に有益です。ただし、その優れた耐薬品性に​​もかかわらず、この研究の実験データは、2707 HDSS が緑膿菌バイオフィルム MIC に対して完全に耐性があるわけではないことを示唆しています。
電気化学的結果は、緑膿菌培養液中の 2707 HDSS の腐食速度が、非生物学的環境と比較して 14 日後に大幅に増加したことを示しました。図 2a では、最初の 24 時間に非生物培地と緑膿菌ブロスの両方で Eocp の減少が観察されました。その後、バイオフィルムがサンプルの表面を完全に覆い、Eocp は比較的安定します36。ただし、生物学的 Eocp レベルは、非生物学的 Eocp レベルよりもはるかに高かった。この違いが緑膿菌バイオフィルムの形成に関連していると信じる理由があります。図上。緑膿菌の存在下で 2 日目に、icorr 2707 HDSS 値は 0.627 μA cm-2 に達しました。これは、非生物的対照 (0.063 μA cm-2) よりも 1 桁高く、測定された Rct 値と一致していました。 EISによる。最初の数日間、緑膿菌ブロスのインピーダンス値は、緑膿菌細胞の付着とバイオフィルムの形成により増加しました。ただし、バイオフィルムがサンプル表面を完全に覆うと、インピーダンスが低下します。保護層は、主にバイオフィルムとバイオフィルム代謝産物の形成により攻撃されます。その結果、耐食性は経時的に低下し、緑膿菌の付着により局部的な腐食が引き起こされました。非生物環境での傾向は異なっていました。非生物学的対照の耐腐食性は、緑膿菌ブロスにさらされたサンプルの対応する値よりもはるかに高かった。さらに、非生物的系統の場合、Rct 2707 HDSS 値は 14 日目に 489 kΩ cm2 に達しました。これは緑膿菌の存在下での Rct 値 (32 kΩ cm2) の 15 倍です。したがって、2707 HDSS は無菌環境で優れた耐食性を備えていますが、緑膿菌のバイオフィルムからの MIC には耐性がありません。
これらの結果は、図 1 および 2 の分極曲線からも観察できます。2b.陽極分岐は、緑膿菌バイオ フィルムの形成と金属酸化反応に関連付けられています。この場合、陰極反応は酸素の還元です。緑膿菌の存在は、腐食電流密度を大幅に増加させ、非生物的対照よりも約 1 桁高くなりました。これは、緑膿菌のバイオフィルムが 2707 HDSS の局所的な腐食を促進することを示しています。Yuan ら 29 は、Cu-Ni 70/30 合金の腐食電流密度が緑膿菌バイオフィルムの作用で増加することを発見しました。これは、緑膿菌バイオフィルムによる酸素還元の生体触媒作用による可能性があります。この観察は、この作品の MIC 2707 HDSS についても説明している可能性があります。また、好気性バイオフィルムの下には酸素が少ない可能性があります。したがって、金属表面を酸素で再不動態化することを拒否することは、この研究でMICに寄与する要因である可能性があります。
ディキンソン等。38は、化学的および電気化学的反応の速度が、サンプル表面の固着細菌の代謝活動と腐食生成物の性質によって直接影響を受ける可能性があることを示唆しました。図 5 および表 5に示すように、細胞数とバイオ フィルムの厚さは 14 日後に減少しました。これは、14 日後、2216E 培地の栄養枯渇または 2707 HDSS マトリックスからの有毒な金属イオンの放出により、2707 HDSS の表面の固着細胞のほとんどが死んだという事実によって合理的に説明できます。これは、バッチ実験の制限です。
この作業では、緑膿菌のバイオフィルムが、2707 HDSS の表面のバイオフィルムの下にある Cr と Fe の局所的な枯渇に寄与しました (図 6)。表 6 は、サンプル C と比較したサンプル D の Fe および Cr の減少を示しており、緑膿菌バイオフィルムによって引き起こされた溶解した Fe および Cr が最初の 7 日間持続したことを示しています。2216E 環境は、海洋環境をシミュレートするために使用されます。17700 ppm の Cl- が含まれており、これは天然の海水に匹敵します。17700 ppm の Cl- の存在が、XPS によって分析された 7 日および 14 日間の非生物サンプルにおける Cr の減少の主な理由でした。緑膿菌サンプルと比較して、非生物的条件下での塩素に対する 2707 HDSS の強い耐性により、非生物的サンプル中の Cr の溶解ははるかに少なくなりました。図上。図９は、パッシベーション膜中のＣｒ６＋の存在を示している。Chen と Clayton によって示唆されているように、緑膿菌のバイオフィルムによるスチール表面からのクロムの除去に関与している可能性があります。
細菌の増殖により、培養前後の培地のpH値はそれぞれ7.4と8.2でした。したがって、緑膿菌のバイオ フィルムの下では、バルク媒体の pH が比較的高いため、有機酸腐食がこの作業に寄与する可能性は低いです。非生物学的対照培地の pH は、14 日間の試験期間中に (最初の 7.4 から最後の 7.5 まで) 大幅に変化しませんでした。インキュベーション後の接種培地の pH の上昇は、緑膿菌の代謝活性と関連しており、テスト ストリップの非存在下で pH に同じ影響を与えることがわかりました。
図 7 に示すように、緑膿菌バイオ フィルムによって引き起こされる最大ピット深さは 0.69 μm であり、非生物培地 (0.02 μm) よりもはるかに大きくなっています。これは、上記の電気化学データと一致しています。0.69 µm というピットの深さは、同じ条件下で 2205 DSS について報告された 9.5 µm の値の 10 分の 1 未満です。これらのデータは、2707 HDSS が 2205 DSS よりも MIC に対して優れた耐性を示すことを示しています。2707 HDSS は Cr レベルが高く、不動態化が長く、緑膿菌の脱不動態化がより困難であり、有害な二次沈殿のないバランスのとれた相構造により、孔食が発生するため、これは驚くべきことではありません。
結論として、MIC ピットは、非生物的環境における取るに足らないピットと比較して、緑膿菌ブロスの 2707 HDSS の表面に見つかりました。この研究は、2707 HDSS が 2205 DSS よりも MIC に対して優れた耐性を持っていることを示していますが、緑膿菌のバイオフィルムのために MIC に対して完全に耐性があるわけではありません。これらの結果は、海洋環境に適したステンレス鋼と寿命の選択に役立ちます。
2707 HDSS のクーポンは、中国の瀋陽にある Northeastern University (NEU) School of Metallurgy から提供されました。2707 HDSS の元素組成を表 1 に示します。この組成は、NEU 材料分析および試験部門によって分析されました。すべてのサンプルは、1180°C で 1 時間固溶体処理されました。腐食試験の前に、上部の開いた表面積が 1 cm2 のコイン型の 2707 HDSS を炭化ケイ素サンドペーパーで 2000 グリットまで研磨し、次に 0.05 µm の Al2O3 粉末スラリーで研磨しました。側面と底面は不活性塗料で保護されています。乾燥後、サンプルを滅菌脱イオン水で洗浄し、75% (v/v) エタノールで 0.5 時間滅菌しました。その後、使用前に 0.5 時間、紫外線 (UV) 光の下で空気乾燥させました。
Marine Pseudomonas aeruginosa 株 MCCC 1A00099 は、中国の Xiamen Marine Culture Collection Center (MCCC) から購入しました。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａは、Ｍａｒｉｎｅ ２２１６Ｅ液体培地（Ｑｉｎｇｄａｏ Ｈｅｐ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｑｉｎｇｄａｏ，Ｃｈｉｎａ）を使用して、２５０ｍｌのフラスコおよび５００ｍｌのガラス電気化学セルにおいて、３７℃で好気条件下で増殖させた。培地には（G/L）：19.45 NaCl、5.98 MgCl2、3.24 Na2SO4、1.8 CACL2、0.55 KCL、0.16 NA2CO3、0.08 KBR、0.034 SRCL2、0.08 SRBR2、0.022 H3BO3、0.004 NASIO3、0016 6NH26NHPENE3、1.016 NH26NH35.016 NH26NH35.016酵母エキスと0.1クエン酸鉄。接種前に 121°C で 20 分間オートクレーブします。光学顕微鏡下で 400 倍の倍率で血球計を使用して固着細胞と浮遊細胞を数えます。接種直後の浮遊性緑膿菌の初期濃度は、約 106 細胞/ml でした。
電気化学試験は、500mlの中容量の古典的な3電極ガラスセルで実施されました。白金シートと飽和カロメル電極 (SAE) は、それぞれ対極と参照電極として機能する塩橋で満たされたルギン毛細管を介して反応器に接続されました。作用電極を製造するために、ゴム引き銅線を各サンプルに取り付け、エポキシ樹脂で覆い、片側に作用電極用の約 1 cm2 の保護されていない領域を残しました。電気化学測定中、サンプルを 2216E 培地に入れ、ウォーターバスで一定のインキュベーション温度 (37°C) に保ちました。OCP、LPR、EIS、および潜在的な動的分極データは、Autolab ポテンシオスタット (Reference 600TM、Gamry Instruments, Inc.、米国) を使用して測定しました。LPR テストは、Eocp および 1 Hz のサンプリング レートを使用して、-5 ～ 5 mV の範囲で 0.125 mV s-1 のスキャン レートで記録されました。EIS は、定常状態 Eocp で 5 mV の印加電圧を使用して、0.01 ～ 10,000 Hz の周波数範囲にわたって正弦波で実行されました。電位スイープの前に、自由腐食電位が安定した値に達するまで、電極はアイドルモードでした。分極曲線は、0.166 mV/s のスキャン速度で Eocp の関数として -0.2 から 1.5 V まで測定されました。緑膿菌の有無にかかわらず、各テストを 3 回繰り返しました。
金属組織分析用のサンプルは、湿った 2000 グリットの SiC 紙で機械的に研磨され、光学観察のために 0.05 µm の Al2O3 粉末懸濁液でさらに研磨されました。光学顕微鏡を用いて金属組織分析を行った。サンプルは、水酸化カリウム 43 の 10 wt% 溶液でエッチングされました。
インキュベーション後、サンプルをリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (pH 7.4 ± 0.2) で 3 回洗浄し、2.5% (v/v) グルタルアルデヒドで 10 時間固定してバイオ フィルムを固定しました。次いで、風乾する前に、バッチエタノール（体積で５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％および１００％）で脱水した。最後に、SEM 観察のための導電性を提供するために、金膜がサンプルの表面に堆積されます。SEM 画像は、各サンプルの表面に最も固着した緑膿菌細胞を含むスポットに焦点を合わせました。化学元素を見つけるために EDS 分析を実行します。Zeiss共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）（LSM 710、Zeiss、Germany）を使用して、ピットの深さを測定しました。バイオフィルムの下の腐食ピットを観察するために、試験サンプルは最初に中国国家標準 (CNS) GB/T4334.4-2000 に従って洗浄され、試験サンプルの表面から腐食生成物とバイオフィルムが除去されました。
X線光電子分光法（XPS、ESCALAB250表面分析システム、Thermo VG、USA）分析は、単色X線源（エネルギー1500 eV、出力150 WのアルミニウムKα線）を使用して、広い範囲で実行されました–1350 eV の標準条件下での結合エネルギーは 0 です。高分解能スペクトルは、50 eV の透過エネルギーと 0.2 eV のステップを使用して記録されました。
インキュベートしたサンプルを取り出し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４±０．２）で１５秒間穏やかに洗浄した４５。サンプル上のバイオフィルムの細菌生存率を観察するために、LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit (Invitrogen、Eugene、OR、USA) を使用してバイオフィルムを染色しました。このキットには、SYTO-9 緑色蛍光色素とヨウ化プロピジウム (PI) 赤色蛍光色素の 2 つの蛍光色素が含まれています。CLSM では、蛍光の緑と赤のドットは、それぞれ生細胞と死細胞を表します。染色のために、3 μl の SYTO-9 と 3 μl の PI 溶液を含む混合液 1 ml を、暗所で室温 (23°C) で 20 分間インキュベートしました。その後、Nikon CLSM 装置 (C2 Plus、Nikon、日本) を使用して、染色されたサンプルを 2 つの波長 (生細胞の場合は 488 nm、死細胞の場合は 559 nm) で調べました。バイオフィルムの厚さは、3D スキャン モードで測定されました。
この記事を引用する方法 ：Li、H. et al。緑膿菌海洋バイオフィルムによる2707スーパー二相ステンレス鋼の微生物腐食。科学。6, 20190. doi: 10.1038/srep20190 (2016).
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