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末梢肺形質導入には治療効果がないため、肺嚢胞性線維症の治療のための遺伝子ベクターは、伝導性気道を標的とする必要があります。ウイルス形質導入の効率は、キャリアの滞留時間に直接関係しています。しかし、遺伝子キャリアなどの送達液は、吸入中に自然に肺胞に拡散し、あらゆる形状の治療用粒子が粘膜繊毛輸送によって迅速に除去されます。気道における遺伝子キャリアの滞留時間を延長することは重要ですが、達成するのは困難です。気道の表面に向けることができるキャリア共役磁性粒子は、地域のターゲティングを改善することができます。生体内イメージングの問題により、適用された磁場の存在下での気道表面上のこのような小さな磁性粒子の挙動はよくわかっていません。この研究の目的は、シンクロトロン イメージングを使用して、麻酔をかけたラットの気管内の一連の磁性粒子の動きを in vivo で可視化し、in vivo での単一およびバルク粒子のダイナミクスと挙動パターンを研究することでした。次に、磁場の存在下でのレンチウイルス磁性粒子の送達がラット気管の形質導入効率を高めるかどうかも評価しました。シンクロトロン X 線イメージングは​​、in vitro および in vivo での静止磁場および移動磁場における磁性粒子の挙動を示します。粒子は、磁石を使用して生きている気道の表面を簡単に引きずることはできませんが、輸送中、堆積物は磁場が最も強い視野に集中します。レンチウイルス磁性粒子が磁場の存在下で送達された場合、形質導入効率も6倍増加しました。まとめると、これらの結果は、レンチウイルス磁性粒子と磁場が、インビボでの伝導性気道における遺伝子ベクターのターゲティングと伝達レベルを改善するための貴重なアプローチである可能性があることを示唆しています。
嚢胞性線維症 (CF) は、CF 膜貫通コンダクタンス制御因子 (CFTR) と呼ばれる単一の遺伝子の変異によって引き起こされます。CFTR タンパク質は、嚢胞性線維症の病因における主要な部位である気道を含む、全身の多くの上皮細胞に存在するイオン チャネルです。CFTR の欠陥は、異常な水分輸送、気道表面の脱水、および気道表面流体層 (ASL) の深さの減少につながります。また、吸入した粒子や病原体を気道から除去する粘液線毛輸送 (MCT) システムの能力も損ないます。私たちの目標は、レンチ ウイルス (LV) 遺伝子治療を開発して、CFTR 遺伝子の正しいコピーを提供し、ASL、MCT、および肺の健康を改善し、in vivo でこれらのパラメーターを測定できる新しい技術を開発し続けることです。
LV ベクターは、主に治療遺伝子を気道基底細胞 (気道幹細胞) に永久に組み込むことができるため、嚢胞性線維症遺伝子治療の主要な候補の 1 つです。嚢胞性線維症に関連する機能的な遺伝子修正された気道表面細胞に分化することにより、正常な水分補給と粘液クリアランスを回復できるため、これは重要です。LV ベクトルは、CF への肺の関与が始まる場所であるため、導電性気道に対して向けられる必要があります。肺へのより深いベクターの送達は、肺胞形質導入をもたらす可能性がありますが、これは嚢胞性線維症の治療効果はありません.しかし、遺伝子キャリアなどの体液は、出産後に吸入すると肺胞に自然に移動し 3,4 、治療用粒子は MCT によって口腔内に急速に排出されます。LV 形質導入の効率は、ベクターが標的細胞の近くにとどまり、細胞への取り込みを可能にする時間の長さに直接関連しています。「滞留時間」 5 は、典型的な局所的な気流と、粘液および MCT 粒子の協調的な取り込みによって容易に短縮されます。嚢胞性線維症の場合、気道での LV 滞留時間を延長する能力は、この領域で高レベルの形質導入を達成するために重要ですが、これまでのところ困難でした。
このハードルを克服するために、LV 磁性粒子 (MP) が 2 つの補完的な方法で役立つことを提案します。第一に、それらは磁石によって気道表面に誘導され、ターゲティングを改善し、遺伝子キャリア粒子が気道の適切な領域にあるのを助けることができます。および ASL) は細胞層 6 に移動します。MP は、抗体、化学療法薬、または細胞膜に付着するか、それぞれの細胞表面受容体に結合して腫瘍部位に蓄積するその他の小分子に結合する場合、標的薬物送達媒体として広く使用されます。静電気の存在。がん治療のための磁場 7. 他の「温熱」法は、振動磁場にさらされたときに MP を加熱することによって腫瘍細胞を殺すことを目的としています。磁場をトランスフェクション剤として使用して細胞への DNA の導入を促進する磁気トランスフェクションの原理は、形質導入が困難な細胞株用のさまざまな非ウイルスおよびウイルス遺伝子ベクターを使用して in vitro で一般的に使用されます。 ..静磁場の存在下でヒト気管支上皮の細胞株にインビトロでLV MPを送達するLV磁気トランスフェクションの効率が確立され、LVベクター単独と比較して186倍の形質導入効率が増加しました。LV MT は、嚢胞性線維症の in vitro モデルにも適用されており、ここで、磁気トランスフェクションは、嚢胞性線維症の喀痰の存在下で気液界面培養における LV 伝達を 20 倍増加させました10。しかし、in vivo 臓器磁気トランスフェクションは比較的ほとんど注目されておらず、いくつかの動物研究 11,12,13,14,15、特に肺 16,17 でしか評価されていません。しかし、嚢胞性線維症の肺治療における磁気トランスフェクションの可能性は明らかです。タン等。(2020) は、「磁性ナノ粒子の効果的な肺送達に関する検証研究は、嚢胞性線維症患者の臨床転帰を改善するための将来の CFTR 吸入戦略への道を開くだろう」と述べています。
適用された磁場の存在下で気道の表面にある小さな磁性粒子の挙動は、視覚化して研究することが困難であり、したがって十分に理解されていません。他の研究では、ガスチャネル表面の水和を直接測定するために、非侵襲的イメージングと ASL18 深さと MCT19 挙動の微小な in vivo 変化の定量化のためのシンクロトロン伝搬ベースの位相コントラスト X 線イメージング (PB-PCXI) 法を開発しました 20。早期治療効果の指標として使用されます。さらに、当社の MCT スコアリング方法では、PB-PCXI21 で可視化される MCT マーカーとして、アルミナまたは高屈折率ガラスで構成される直径 10 ～ 35 μm の粒子を使用します。どちらの方法も、MP を含む一連の粒子タイプのイメージングに適しています。
高い空間分解能と時間分解能により、当社の PB-PCXI ベースの ASL および MCT アッセイは、in vivo での単一およびバルク粒子のダイナミクスと行動パターンの研究に適しており、MP 遺伝子送達方法の理解と最適化に役立ちます。ここで使用するアプローチは、SPring-8 BL20B2 ビームラインを使用した研究に基づいています。そこでは、観察された異種遺伝子発現パターンを説明するために、ダミーベクターをマウスの鼻および肺気道に送達した後の流体の動きを視覚化しました。私たちの遺伝子に。キャリア用量 3.4 の動物実験。
この研究の目的は、PB-PCXI シンクロトロンを使用して、生きたラットの気管における一連の MP の生体内の動きを視覚化することでした。これらの PB-PCXI イメージング研究は、MP シリーズ、磁場強度、および位置をテストして、MP の動きに対する影響を判断するように設計されました。外部磁場は、配信されたMFがターゲット領域にとどまるか移動するのに役立つと想定しました。これらの研究により、堆積後に気管に残る粒子の量を最大化する磁石構成を決定することもできました。2 番目の一連の研究では、この最適な構成を使用して、ラットの気道への LV-MP の in vivo 送達に起因する伝達パターンを実証することを目的としました。 LV 形質導入効率の向上。.
すべての動物研究は、アデレード大学 (M-2019-060 および M-2020-022) および SPring-8 シンクロトロン動物倫理委員会によって承認されたプロトコルに従って実施されました。実験は、ARRIVE の推奨事項に従って実施されました。
すべての X 線画像は、以前に説明したものと同様のセットアップを使用して、日本の SPring-8 シンクロトロンの BL20XU ビームラインで撮影されました 。簡単に言えば、実験ボックスはシンクロトロンストレージリングから 245 m の位置にありました。サンプルから検出器までの距離は、粒子イメージング研究では 0.6 m、in vivo イメージング研究では 0.3 m を使用して、位相コントラスト効果を作成します。25 keV のエネルギーを持つ単色ビームを使用しました。画像は、sCMOS 検出器に結合された高解像度 X 線トランスデューサ (SPring-8 BM3) を使用して取得されました。トランスデューサは、厚さ 10 μm のシンチレータ (Gd3Al2Ga3O12) を使用して X 線を可視光に変換し、それを 10 倍 (NA 0.3) 顕微鏡対物レンズを使用して sCMOS センサーに向けます。sCMOS検出器は、アレイサイズが2048×2048ピクセル、生ピクセルサイズが6.5×6.5 µmのOrca-Flash4.0（浜松ホトニクス、日本）でした。この設定により、有効な等方性ピクセル サイズが 0.51 µm になり、視野が約 1.1 mm × 1.1 mm になります。100 ミリ秒の露出時間は、呼吸によって引き起こされるモーション アーティファクトを最小限に抑えながら、気道の内外の磁性粒子の信号対雑音比を最大化するために選択されました。in vivo 研究では、高速 X 線シャッターを X 線パスに配置して、露光間の X 線ビームをブロックすることで放射線量を制限しました。
BL20XUイメージングチャンバーはバイオセーフティレベル2認定を受けていないため、LVメディアはSPring-8 PB-PCXIイメージング研究では使用されませんでした。代わりに、さまざまなサイズ、材料、鉄濃度、およびアプリケーションをカバーする 2 つの商用ベンダーから、特性の明確な一連の MP を選択しました。生きている気道。水面。MP のサイズは 0.25 ～ 18 μm で、さまざまな材料で作られていますが (表 1 を参照)、MP 内の磁性粒子のサイズを含む各サンプルの組成は不明です。当社の広範な MCT 研究 19、20、21、23、24 に基づいて、たとえば、連続したフレームを減算して MP ​​の動きの視認性を向上させることにより、気管の気道表面で 5 µm までの MP を確認できると予想しています。0.25 μm の単一 MP は、イメージング デバイスの解像度よりも小さいですが、PB-PCXI は、体積コントラストと、堆積後の表面液体の動きを検出することが期待されます。
テーブル内の各 MP のサンプル。1 は、内径 0.63 mm の 20 μl ガラスキャピラリー (Drummond Microcaps, PA, USA) で調製されました。微粒子は水中で入手できますが、CombiMag 粒子はメーカー独自の液体で入手できます。各チューブの半分は液体 (約 11 µl) で満たされ、サンプル ホルダーに置かれます (図 1 を参照)。ガラスキャピラリーは、それぞれイメージングチャンバーのステージ上に水平に配置され、液体の端に配置されました。希土類、ネオジム、鉄、ホウ素 (NdFeB) で作られた直径 19 mm (長さ 28 mm) のニッケルシェル磁石 (N35、カタログ番号 LM1652、Jaycar Electronics、オーストラリア) が残留磁気 1.17 T で、磁石に取り付けられました。別の転送テーブルを達成するために、レンダリング中にリモートで位置を変更します。X 線イメージングは​​、磁石がサンプルの約 30 mm 上に配置されたときに開始され、画像は毎秒 4 フレームで取得されます。イメージング中、磁石をガラスキャピラリーチューブに近づけ（約1 mmの距離）、チューブに沿って移動させて、磁場の強さと位置の影響を評価しました。
xy サンプルの翻訳段階で、ガラス毛細管に MP サンプルを含む in vitro イメージング セットアップ。X 線ビームの経路は赤い点線でマークされています。
MP の in vitro 可視性が確立されると、それらのサブセットが in vivo で野生型雌ウィスター アルビノ ラット (約 12 週齢、約 200 g) でテストされました。メデトミジン 0.24 mg/kg (Domitor®、Zenoaq、日本)、ミダゾラム 3.2 mg/kg (Dormicum®、アステラス ファーマ、日本)、およびブトルファノール 4 mg/kg (Vetorphale®、明治製菓)。ラットは、Pharma (Japan) 混合物で腹腔内注射により麻酔した。麻酔後、気管の周りの毛皮を取り除き、気管内チューブ (ET; 16 Ga 静脈カニューレ、テルモ BCT) を挿入し、サーマルバッグを含むカスタムメイドのイメージングプレートに仰臥位で固定することにより、イメージングの準備をしました。体温を維持するために。22. 次に、図 2a に示すように、イメージング プレートをイメージング ボックス内のサンプル ステージにわずかな角度で取り付けて、X 線画像上で気管を水平に配置しました。
(a) SPring-8 イメージング ユニットの in vivo イメージング セットアップ、赤い点線でマークされた X 線ビーム パス。(b、c) 気管磁石の位置特定は、直交して取り付けられた 2 台の IP カメラを使用してリモートで実行されました。画面の画像の左側に、ヘッドを保持するワイヤー ループと ET チューブ内に取り付けられたデリバリー カニューレが見えます。
100 μl ガラス製シリンジを使用するリモート制御シリンジ ポンプ システム (UMP2、World Precision Instruments、フロリダ州サラソタ) を、30 Ga 針を使用して PE10 チューブ (外径 0.61 mm、内径 0.28 mm) に接続しました。気管内チューブを挿入するときに、先端が気管内の正しい位置にあることを確認するために、チューブに印を付けます。マイクロポンプを使用して、シリンジプランジャーを取り外し、チューブの先端をMPサンプルに浸して送達しました。次に、ロードされたデリバリーチューブを気管内チューブに挿入し、予想される印加磁場の最も強い部分に先端を配置しました。画像取得は、Arduino ベースのタイミング ボックスに接続された呼吸検出器を使用して制御され、Powerlab と LabChart (AD Instruments、シドニー、オーストラリア) を使用してすべての信号 (温度、呼吸、シャッターの開閉、画像取得など) が記録されました。 22 イメージング時 ハウジングが使用できない場合、2 台の IP カメラ (Panasonic BB-SC382) を互いに約 90° に配置し、イメージング中に気管に対する磁石の位置を制御するために使用しました (図 2b、c)。モーション アーティファクトを最小限に抑えるために、終末の呼吸フロー プラトーの間に、1 呼吸あたり 1 つの画像を取得しました。
磁石は、イメージング本体の外側に離れた位置にある第 2 ステージに取り付けられます。磁石のさまざまな位置と構成がテストされました。1 つの磁石を動物の上に、もう 1 つの磁石を下に配置し、極を引き付けるように設定します (図 3b)。、動物の上に 1 つの磁石と下に 1 つ、反発用に設定された極 (図 3c)、および上と気管に垂直な 1 つの磁石 (図 3d)。動物と磁石を設定し、テスト対象の MP をシリンジ ポンプにロードした後、画像の取得時に 4 μl/秒の速度で 50 μl の用量を提供します。次に、画像を取得し続けながら、気管に沿って、または気管を横切って磁石を前後に​​動かします。
in vivo イメージング用の磁石構成 (a) 約 30° の角度で気管の上にある 1 つの磁石、(b) 吸引用に構成された 2 つの磁石、(c) 反発用に構成された 2 つの磁石、(d) 上に垂直な 1 つの磁石気管。観察者は口から気管を通して肺を見下ろし、X 線ビームはラットの左側を通過して右側から出ました。磁石は、気道の長さに沿って移動するか、X 線ビームの方向に気管の上を左右に移動します。
また、呼吸と心拍数が混在していない場合の気道内の粒子の可視性と挙動を決定しようとしました。したがって、イメージング期間の終わりに、動物はペントバルビタールの過剰摂取により人道的に安楽死させられました（ソムノペンチル、ピットマン-ムーア、ワシントンクロッシング、米国、〜65 mg / kg ip）。一部の動物はイメージング プラットフォームに残され、呼吸と心拍が停止した後、気道表面に MP が見えない場合は MP を追加してイメージング プロセスが繰り返されました。
得られた画像は、フラット フィールドとダーク フィールドに対して補正され、MATLAB (R2020a、The Mathworks) で記述されたカスタム スクリプトを使用して、ムービー (毎秒 20 フレーム、呼吸数に応じて通常の速度の 15 ～ 25 倍) にまとめられました。
LV 遺伝子ベクター送達に関するすべての研究は、アデレード大学実験動物研究センターで実施され、SPring-8 実験の結果を使用して、磁場の存在下での LV-MP 送達が in vivo での遺伝子導入を促進できるかどうかを評価することを目的としていました。 .MF と磁場の効果を評価するために、動物の 2 つのグループが扱われました: 1 つのグループは、磁石の配置で LV MF を注射し、他のグループは磁石なしで LV MF をコントロール グループに注射しました。
ＬＶ遺伝子ベクターは、以前に記載された方法 ２５、２６ を使用して生成された。LacZ ベクターは、MPSV 構成的プロモーター (LV-LacZ) によって駆動される核局在化ベータ-ガラクトシダーゼ遺伝子を発現します。この遺伝子は、形質導入された細胞で青色の反応生成物を生成し、肺組織の前面と切片で確認できます。血球計を使用してLacZ陽性細胞の数を手動でカウントし、TU/mlで力価を計算することにより、細胞培養で力価測定を行った。担体は、-80°C で凍結保存され、使用前に解凍され、1:1 で混合され、配送前に少なくとも 30 分間氷上でインキュベートされることにより、CombiMag に結合されます。
正常な Sprague Dawley ラット (n = 3/グループ、生後 1 か月で 0.4mg/kg メデトミジン (Domitor、腸骨、オーストラリア) と 60mg/kg ケタミン (腸骨、オーストラリア) の混合物で腹腔内麻酔) ip ) 注射および 16 Ga 静脈内カニューレによる非外科的経口カニューレ挿入。気管気道組織が LV 伝達を確実に受けるようにするために、気管気道表面がワイヤー バスケット (N-Circle、チップ NTSE-022115 なしのニチノール結石抽出器) で軸方向にこすられた、前述の機械的摂動プロトコルを使用して調整されました。クック メディカル、米国) 30 p28。その後、バイオセーフティキャビネット内の摂動から約10分後に、LV-MPの気管投与を行った。
この実験で使用される磁場は、in vivo x 線研究と同様に構成され、同じ磁石が蒸留ステント クランプで気管に保持されました (図 4)。LV-MP の 50 μl 量 (2 x 25 μl アリコート) を、前述のようにゲルチップ付きピペットを使用して気管 (n = 3 動物) に送達しました。コントロール グループ (n = 3 動物) は、磁石を使用せずに同じ LV-MP を受け取りました。注入の完了後、カニューレを気管内チューブから取り外し、動物を抜管します。磁石は、取り外す前に 10 分間所定の位置に留まります。ラットにメロキシカム (1 ml/kg) (腸骨、オーストラリア) を皮下投与し、続いて 1 mg/kg アチパマゾール塩酸塩 (Antisedan、Zoetis、オーストラリア) を腹腔内注射して麻酔を解除した。麻酔から完全に回復するまで、ラットを保温し、観察した。
生物学的安全キャビネット内の LV-MP 送達装置。ET チューブのライトグレーのルアーロックスリーブが口から出ているのが分かります。図のゲルピペットチップが ET チューブを通して気管の所望の深さまで挿入されています。
LV-MP 投与手順の 1 週間後、動物を 100% CO2 の吸入によって人道的に屠殺し、標準的な X-gal 処理を使用して LacZ 発現を評価しました。気管内チューブの配置による機械的損傷または体液貯留が分析に含まれないようにするために、最も尾側の 3 つの軟骨輪を除去しました。各気管を縦に切断して分析用に 2 つの半分にし、Minutien 針 (Fine Science Tools) を使用してシリコン ゴム (Sylgard、Dow Inc) を含むカップに入れて、管腔表面を視覚化しました。形質導入された細胞の分布と特徴は、DigiLite カメラと TCapture ソフトウェア (Tucsen Photonics、中国) を備えた Nikon 顕微鏡 (SMZ1500) を使用した正面写真によって確認されました。画像は 20 倍の倍率 (気管の全幅の最大設定を含む) で取得され、気管の全長が段階的に表示され、各画像間に十分な重なりがあり、画像を「つなぎ合わせる」ことができます。次に、各気管からの画像を、平面運動アルゴリズムを使用する Composite Image Editor バージョン 2.0.3 (Microsoft Research) を使用して単一の合成画像に結合しました。 各動物の気管合成画像内の LacZ 発現の領域は、前述のように 0.35 < 色相 < 0.58、彩度 > 0.15、および値 < 0.7 の設定を使用して、自動化された MATLAB スクリプト (R2020a、MathWorks) を使用して定量化されました。 各動物の気管合成画像内の LacZ 発現の領域は、0.35 < 色相 < 0.58、彩度 > 0.15、および値 < 0.7 の設定を使用して、前述のように自動 MATLAB スクリプト (R2020a、MathWorks) を使用して定量化されました。 Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественно определена с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0 、7。 各動物からの合成気管画像における LacZ 発現の領域は、自動化された MATLAB スクリプト (R2020a、MathWorks) を使用して、0.35 の設定を使用して前述のように定量化されました。0.15 および値 <0 .7。前述のように、自動 MATLAB スクリプト (R2020a、MathWorks) を使用して、0.35 < 色度 < 0.58、彩度 > 0.15 および値 < 0.7 の設定を使用して、各動物の気管結合画像の LacZ 表領域を定量化します。前に述べたように、自動自動 Matlab スクリプト ((r2020a , Mathworks) は、すべての気管からの画像を組み合わせたものです。ヒップ Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определяли с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0,7 . 0.35 < 色相 < 0.58、彩度 > 0.15 および値 < 0.7 の設定を使用して、前述のように、自動化された MATLAB スクリプト (R2020a、MathWorks) を使用して、各動物の気管の合成画像上の LacZ 発現領域を定量化しました。GIMP v2.10.24 で組織の輪郭を追跡することにより、合成画像ごとにマスクを手動で作成して、組織領域を識別し、気管組織の外側での誤検出を防止しました。各動物からのすべての合成画像からの染色面積を合計して、その動物の全染色面積を得た。次に、塗装面積をマスクの総面積で割り、正規化された面積を得ました。
各気管はパラフィンに包埋され、厚さ 5 μm に切片化されました。切片をニュートラル ファスト レッドで 5 分間対比染色し、Nikon Eclipse E400 顕微鏡、DS-Fi3 カメラ、および NIS エレメント キャプチャ ソフトウェア（バージョン 5.20.00）を使用して画像を取得しました。
すべての統計分析は、GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.) で実行されました。統計的有意性は p ≤ 0.05 に設定されました。Shapiro-Wilk テストを使用して正規性をテストし、対応のない t 検定を使用して LacZ 染色の違いを評価しました。
表 1 に記載されている 6 つの MP は PCXI によって検査され、可視性は表 2 に記載されています。 (例を図 5 に示します)。MP3 と MP4 はわずかに見えます (10 ～ 15% Fe3O4、それぞれ 0.25 μm と 0.9 μm)。MP5 (98% Fe3O4; 0.25 µm) には、テストした最小の粒子がいくつか含まれていましたが、最も顕著でした。CombiMag MP6 製品は見分けるのが困難です。いずれの場合も、磁石をキャピラリーと平行に前後に動かすことで、MF を検出する能力が大幅に向上しました。磁石がキャピラリーから遠ざかるにつれて、粒子は長い鎖で引き出されましたが、磁石が近づき、磁場強度が増加すると、粒子がキャピラリーの上面に向かって移動するにつれて粒子鎖が短くなりました (補足ビデオ S1 を参照)。 : MP4)、表面の粒子密度を増加させます。逆に、磁石がキャピラリーから取り外されると、磁場強度が低下し、MP がキャピラリーの上面から伸びる長いチェーンに再配置されます (補足ビデオ S2: MP4 を参照)。磁石の動きが止まった後、粒子は平衡位置に達した後もしばらく動き続けます。MP がキャピラリの上面に近づいたり離れたりすると、磁性粒子が液体中の破片を引き寄せる傾向があります。
PCXI での MP の可視性は、サンプル間で大きく異なります。(a) MP3、(b) MP4、(c) MP5、および (d) MP6。ここに示されているすべての画像は、キャピラリーの真上約 10 mm に配置された磁石で撮影されました。明らかな大きな円は、毛細血管に閉じ込められた気泡であり、位相コントラスト画像の黒と白のエッジの特徴を明確に示しています。赤いボックスは、コントラストを高める倍率を示します。すべての図の磁気回路の直径は縮尺どおりではなく、示されているよりも約 100 倍大きいことに注意してください。
磁石がキャピラリーの上部に沿って左右に移動すると、MP ストリングの角度が変化して磁石と整列し (図 6 を参照)、磁力線の輪郭を描きます。MP3-5 の場合、弦がしきい値の角度に達した後、粒子はキャピラリーの上面に沿って引きずられます。これにより、多くの場合、磁場が最も強い場所の近くで MP がより大きなグループにクラスター化されます (補足ビデオ S3: MP5 を参照)。これは、キャピラリーの端に近いイメージングを行う場合にも特に顕著であり、MP が液体と空気の界面で凝集して集中します。MP3-5 よりも区別が難しい MP6 の粒子は、磁石がキャピラリーに沿って移動したときに引きずられませんでしたが、MP ストリングは解離し、粒子が見えたままになりました (補足ビデオ S4: MP6 を参照)。場合によっては、磁石をイメージング部位から遠くに移動して印加磁場を減らすと、残りの MP は重力によってチューブの底面にゆっくりと下降し、ストリングに残ります (補足ビデオ S5: MP3 を参照)。 .
磁石がキャピラリの真上に移動すると、MP ストリングの角度が変化します。(a) MP3、(b) MP4、(c) MP5、および (d) MP6。赤いボックスは、コントラストを高める倍率を示します。追加のビデオは、これらの静止画像では視覚化できない重要な粒子構造と動的情報を明らかにするため、情報提供を目的としていることにご注意ください。
私たちのテストでは、磁石を気管に沿ってゆっくりと前後に動かすと、in vivo での複雑な動きのコンテキストで MF の視覚化が容易になることが示されました。ポリスチレン ビーズ (MP1 および MP2) がキャピラリー内で見えなかったため、in vivo 試験は行われませんでした。残りの 4 つの MF のそれぞれは、磁石の長軸が垂直に対して約 30° の角度で気管上に配置された状態で in vivo でテストされました (図 2b および 3a を参照)。これにより、MF チェーンが長くなり、より効果的でした。磁石より。.構成が終了しました。MP3、MP4、および MP6 は、生きている動物の気管には見つかりませんでした。動物を人道的に殺した後、ラットの気道を視覚化すると、シリンジポンプを使用して追加のボリュームを追加しても、粒子は見えないままでした。MP5 は酸化鉄含有量が最も高く、目に見える唯一の粒子であったため、in vivo での MP の挙動を評価および特徴付けるために使用されました。
MF の挿入中に気管に磁石を配置すると、すべてではありませんが多くの MF が視野に集中しました。粒子の気管への侵入は、人道的に安楽死させた動物で最もよく観察されます。図 7 および補足ビデオ S6: MP5 は、腹側気管の表面での粒子の急速な磁気捕捉と整列を示しており、MP を気管の目的の領域にターゲティングできることを示しています。MF 送達後に気管に沿ってより遠位に検索すると、いくつかの MF が気管分岐部の近くで見つかりました。これは、流体投与中に最大磁場強度の領域を介して送達されたため、すべての MF を収集して保持するには磁場強度が不十分であることを示しています。処理する。しかし、出生後の MP 濃度は画像領域周辺でより高く、印加磁場強度が最も高い気道領域に多くの MP が残っていることが示唆されました。
最近安楽死させたラットの気管に MP5 を送達する前 (a) と (b) の画像。磁石をイメージング領域のすぐ上に配置した。描かれている領域は、2 つの軟骨リングの間に位置しています。MP が送達される前に、気道にいくらかの液体があります。赤いボックスは、コントラストを高める倍率を示します。これらの画像は、S6: MP5 Supplementary Video で紹介されているビデオから取得されています。
in vivo で気管に沿って磁石を動かすと、毛細血管で観察されるのと同様に、気道表面の MP チェーンの角度が変化しました (図 8 および補足ビデオ S7: MP5 を参照)。ただし、私たちの研究では、毛細血管のように MP を生きている気道の表面に沿って引きずることはできませんでした。場合によっては、磁石が左右に動くと MP チェーンが長くなります。興味深いことに、磁石が気管に沿って縦方向に移動すると、粒子鎖が流体の表層の深さを変化させ、磁石が真上に移動し、粒子鎖が垂直位置に回転すると拡大することもわかりました（補足ビデオ S7)。: MP5 0:09、右下)。特徴的な動きのパターンは、磁石が気管の上部を横切って横方向に移動したときに変化しました (つまり、気管の長さに沿ってではなく、動物の左または右に)。粒子は移動中もはっきりと見えましたが、気管から磁石を取り除くと、粒子列の先端が見えるようになりました (0:08 から始まる補足ビデオ S8: MP5 を参照)。これは、ガラスキャピラリーに印加された磁場の作用下で観測された磁場の挙動と一致します。
生きた麻酔ラットの気管内の MP5 を示すサンプル画像。(a) 磁石を使用して気管の上と左側の画像を取得し、(b) 磁石を右に移動した後。赤いボックスは、コントラストを高める倍率を示します。これらの画像は、S7 の補足ビデオ: MP5 で紹介されているビデオからのものです。
2つの極が気管の上下で南北方向に調整された場合（つまり、引き付けます;図3b）、MP弦はより長く見え、気管の背面ではなく気管の側壁に位置していました。気管（付録を参照）。ビデオ S9:MP5)。しかし、1 つのサイト (すなわち、気管の背側表面) での高濃度の粒子は、通常は単一の磁石デバイスで発生するデュアル磁石デバイスを使用した流体投与後に検出されませんでした。次に、1 つの磁石が反対の極を反発するように構成された場合 (図 3c)、視野内に見える粒子の数は、送達後に増加しませんでした。2 つの磁石構成の両方を設定することは、それぞれ磁石を引き付けたり押したりする磁場強度が高いため困難です。次に、セットアップを気道に平行な単一の磁石に変更しましたが、気道を 90 度の角度で通過するようにして、力線が気管壁を直交するようにしました (図 3d)。側壁。観察されます。ただし、この構成では、識別可能な MF 蓄積の動きや磁石の動きはありませんでした。これらすべての結果に基づいて、遺伝子キャリアの in vivo 研究のために、単一の磁石と30度の向きを備えた構成が選択されました（図3a）。
動物が人道的に犠牲にされた直後に複数回画像化されたとき、干渉する組織の動きがないということは、磁石の並進運動に従って「揺れる」明確な軟骨間フィールドで、より細かく短い粒子線を識別できることを意味しました。MP6 粒子の存在と動きがはっきりとわかります。
LV-LacZ の力価は 1.8 x 108 IU/mL で、CombiMag MP (MP6) と 1:1 で混合した後、9 x 107 IU/mL の LV ビヒクル (すなわち 4.5 x 106 TU/ラット)。））。これらの研究では、陣痛中に磁石を動かす代わりに、磁石を 1 つの位置に固定して、左室伝達が (a) 磁場がない場合のベクター送達と比較して改善されるかどうか、および (b) 気道が改善されるかどうかを判断しました。集中する。上気道の磁気標的領域で形質導入される細胞。
磁石の存在と LV ベクターと組み合わせた CombiMag の使用は、標準的な LV ベクター配信プロトコルと同様に、動物の健康に悪影響を与えるようには見えませんでした。機械的摂動を受けた気管領域の正面画像（補足図1）は、LV-MP治療群が磁石の存在下で有意に高いレベルの形質導入を有することを示しました（図9a）。対照群では、少量の青色の LacZ 染色のみが見られました (図 9b)。X-Gal染色された正規化領域の定量化により、磁場の存在下でLV-MPを投与すると、約6倍の改善が得られたことが示されました（図9c）。
LV-MP (a) 磁場の存在下、(b) 磁石の非存在下での気管変換を示す合成画像の例。(c) 磁石を使用した気管内の LacZ 変換の正規化された領域の統計的に有意な改善 (*p = 0.029、t 検定、グループごとに n = 3、平均 ± 平均の標準誤差)。
ニュートラルファストレッド染色切片（補足図2に示す例）は、LacZ染色細胞が以前に報告されたのと同じサンプルおよび同じ場所に存在することを示しました。
気道遺伝子治療における重要な課題は、関心のある領域でのキャリア粒子の正確な局在化と、気流と活発な粘液クリアランスの存在下での可動肺における高レベルの形質導入効率の達成です。嚢胞性線維症における呼吸器疾患の治療を目的とした LV キャリアの場合、導電性気道内のキャリア粒子の滞留時間を増加させることは、これまで達成不可能な目標でした。カステラーニらが指摘したように、磁場を使用して形質導入を促進することは、エレクトロポレーションなどの他の遺伝子送達方法よりも利点があります。これは、シンプルさ、経済性、局所送達、効率の向上、およびインキュベーション時間の短縮を組み合わせることができるためです。そしておそらくより低い用量のビヒクル10。ただし、外部磁力の影響下での気道内の磁性粒子の in vivo 沈着および挙動は記載されておらず、実際、無傷の生きた気道で遺伝子発現レベルを増加させるこの方法の能力は in vivo で実証されていません。
PCXI シンクロトロンでの in vitro 実験では、MP ポリスチレンを除いて、テストしたすべての粒子が、使用したイメージング設定で見えることが示されました。磁場の存在下では、磁場がストリングを形成し、その長さは、粒子の種類と磁場の強さ (つまり、磁石の接近と動き) に関連しています。図 10 に示すように、個々の粒子が磁化され、独自の局所磁場を誘導するにつれて、ストリングが形成されます。これらの別々の場は、他の粒子の局所的な引力と反発力による局所的な力により、他の同様の粒子を集め、グループストリングの動きに結び付けます。
(a、b) 流体で満たされた毛細血管内で形成される粒子の連鎖、および (c、d) 空気で満たされた気管を示す図。毛細血管と気管は一定の縮尺で描かれていないことに注意してください。パネル (a) には、鎖状に配置された Fe3O4 粒子を含む MF の説明も含まれています。
磁石がキャピラリー上を移動すると、粒子列の角度が Fe3O4 を含む MP3-5 の臨界しきい値に達し、その後、粒子列は元の位置に留まらず、表面に沿って新しい位置に移動しました。磁石。この効果は、ガラス キャピラリーの表面がこの動きを可能にするほど滑らかであるために発生する可能性があります。興味深いことに、MP6 (CombiMag) はこのように動作しませんでした。これはおそらく、粒子が小さいか、コーティングまたは表面電荷が異なるか、独自のキャリア流体が粒子の移動能力に影響を与えたためです。CombiMag 粒子画像のコントラストも弱くなっています。これは、液体と粒子が同じ密度を持っている可能性があるため、互いに簡単に移動できないことを示唆しています。また、磁石の動きが速すぎると粒子がくっつく可能性があります。これは、磁場の強さが流体内の粒子間の摩擦を常に克服できるとは限らないことを示しています。サプライズ。重要。これらの結果はまた、磁石は標的領域を流れる多くの微粒子を捕捉できるが、磁石が気管の表面に沿って CombiMag 粒子を移動させることに依存できる可能性は低いことを示しています。したがって、in vivo LV MF 研究では静磁場を使用して、気道樹の特定の領域を物理的に標的にする必要があると結論付けました。
粒子が体内に送達されると、身体の複雑に動く組織のコンテキストで識別することは困難ですが、気管上で磁石を水平に動かして MP ​​ストリングを「小刻みに動かす」ことにより、粒子の検出能力が向上しました。リアルタイム イメージングは​​可能ですが、動物が人道的に殺された後の粒子の動きを識別する方が簡単です。MP 濃度は通常、磁石がイメージング領域の上に配置されたときにこの場所で最も高くなりましたが、いくつかの粒子は通常、気管のさらに下で見つかりました。in vitro 研究とは異なり、粒子は磁石の動きによって気管に引きずり込まれることはありません。この所見は、気管の表面を覆う粘液が通常、吸入された粒子を処理し、粘液に閉じ込め、粘液繊毛クリアランスメカニズムを通じて除去する方法と一致しています。
気管の上下に磁石を使用して吸引すると（図3b）、一点に高度に集中した磁場ではなく、より均一な磁場が得られ、粒子の分布がより均一になる可能性があると仮定しました。.ただし、予備調査では、この仮説を支持する明確な証拠は見つかりませんでした。同様に、一対の磁石を反発するように設定しても（図3c）、画像領域に粒子がより多く沈降することはありませんでした。これらの 2 つの調査結果は、デュアル マグネット設定が MP ポインティングのローカル制御を大幅に改善しないこと、および結果として生じる強力な磁力を調整することが困難であることを示しており、このアプローチは実用的ではありません。同様に、磁石を気管の上および横に向けても (図 3d)、撮像領域に残っている粒子の数は増加しませんでした。これらの代替構成のいくつかは、堆積ゾーンの磁場強度の低下をもたらすため、うまくいかない場合があります。したがって、30 度の単一磁石構成 (図 3a) は、最も単純で最も効率的な in vivo 試験方法と考えられています。
LV-MP研究は、LVベクターがCombiMagと組み合わされ、磁場の存在下で物理的に妨害された後に送達されると、コントロールと比較して気管の形質導入レベルが大幅に増加することを示しました.シンクロトロン イメージング研究と LacZ の結果に基づいて、磁場は LV を気管内に保持し、肺の奥深くまで直接浸透したベクター粒子の数を減らすことができるように見えました。このようなターゲティングの改善は、配信力価、非標的伝達、炎症性および免疫の副作用、および遺伝子導入コストを削減しながら、より高い効率につながる可能性があります。重要なのは、メーカーによると、CombiMag は他のウイルスベクター (AAV など) や核酸を含む他の遺伝子導入方法と組み合わせて使用​​できることです。