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トキソプラズマ原虫は、感染した宿主の微小環境を調節する細胞内原虫であり、脳腫瘍増殖の発生率と関連することが知られています。この研究では、トキソプラズマ感染によるエキソソーム miRNA-21 が脳腫瘍の増殖を促進するという仮説を立てています。トキソ プラズマ感染 BV2 ミクログリアからのエキソソームが特徴付けられ、U87 神経膠腫細胞の内在化が確認されました。エキソソーム マイクロ RNA 発現プロファイルは、トキソプラズマ ゴンディおよび腫瘍選別に関連するマイクロ RNA およびマイクロ RNA-21A-5p のアレイを使用して分析されました。また、エキソソームのmiR-21レベルを変更することにより、U87グリオーマ細胞の腫瘍関連遺伝子のmRNAレベルと、ヒトU87グリオーマ細胞の増殖に対するエキソソームの影響を調査しました。トキソプラズマ・ゴンディに感染したU87神経膠腫細胞のエクソソームでは、マイクロRNA-21の発現が増加し、抗腫瘍遺伝子（FoxO1、PTEN、およびPDCD4）の活性が低下します。トキソプラズマに感染した BV2 由来のエキソソームは、U87 神経膠腫細胞の増殖を誘導します。エキソソームは、マウス腫瘍モデルで U87 細胞の増殖を誘導します。トキソプラズマ感染 BV2 ミクログリアにおけるエキソソーム miR-21 の増加は、抗腫瘍遺伝子をダウンレギュレートすることにより、U87 神経膠腫細胞の細胞増殖プロモーターとして重要な役割を果たす可能性があることを示唆しています。
2018 年には世界中で 1,810 万件以上の進行がんが診断され、毎年約 297,000 件の中枢神経系腫瘍が診断されていると推定されています (全腫瘍の 1.6%)1。以前の研究では、人間の脳腫瘍を発症する危険因子には、さまざまな化学製品、家族歴、および頭部の治療および診断機器からの電離放射線が含まれることが示されています。しかし、これらの悪性腫瘍の正確な原因は不明です。世界中のすべてのがんの約 20% は、ウイルス、細菌、寄生虫などの感染性病原体によって引き起こされます 3,4。感染性病原体は、DNA 修復や細胞周期などの宿主細胞の遺伝的メカニズムを混乱させ、慢性炎症や免疫系への損傷を引き起こす可能性があります 5。
ヒトの癌に関連する感染性病原体は、ヒトパピローマウイルスや B 型肝炎ウイルス、C 型肝炎ウイルスなど、最も一般的なウイルス病原体です。寄生虫はまた、ヒトのがんの発症において潜在的な役割を果たす可能性があります。いくつかの寄生虫種、すなわち住血吸虫、Opishorchis viverrini、O. felineus、Clonorchis sinensis、および Hymenolepis nana は、さまざまな種類のヒトの癌に関与しています 6,7,8。
トキソプラズマ原虫は、感染した宿主細胞の微小環境を調節する細胞内原生動物です。この寄生虫は、世界人口の約 30% に感染すると推定されており、全人口が危険にさらされています9,10。トキソ プラズマ原虫は、中枢神経系 (CNS) を含む生命維持に必要な臓器に感染し、特に免疫不全患者において、致命的な髄膜炎や脳炎などの深刻な病気を引き起こす可能性があります 9。しかし、トキソ プラズマ原虫は、無症候性慢性感染症の維持につながる免疫適格者の細胞増殖と免疫応答を調節することによって、感染した宿主の環境を変えることもできます9,11。興味深いことに、T. gondii の有病率と脳腫瘍の発生率との相関関係を考えると、T. gondii の慢性感染による in vivo 宿主環境の変化が腫瘍の微小環境に似ていることを示唆する報告がいくつかあります。
エキソソームは、タンパク質や核酸などの生物学的内容を隣接細胞から送達する細胞間コミュニケーターとして知られています16,17。エキソソームは、腫瘍微小環境における抗アポトーシス、血管新生、転移などの腫瘍関連の生物学的プロセスに影響を与える可能性があります。特に、長さが約 22 ヌクレオチドの小さな非コード RNA である miRNA (miRNA) は、miRNA 誘導サイレンシング複合体 (miRISC) を介してヒト mRNA の 30% 以上を制御する重要な転写後遺伝子調節因子です。トキソプラズマ原虫は、感染した宿主での miRNA 発現を制御することにより、生物学的プロセスを混乱させる可能性があります。宿主 miRNA には、宿主の生物学的プロセスを調節して寄生虫の生存戦略を達成するための重要なシグナルが含まれています。したがって、T. gondii に感染した際の宿主の miRNA プロファイルの変化を研究することは、宿主と T. gondii の間の相互作用をより明確に理解するのに役立ちます。確かに、ティルグナナム等。15 は、T. gondii が腫瘍増殖に関連する特定の宿主 miRNA の発現を変化させることによって脳の発癌を促進することを示唆し、T. gondii が実験動物で神経膠腫を引き起こす可能性があることを発見しました。
この研究は、トキソプラズマ BV2 に感染した宿主ミクログリアにおけるエキソソーム miR-21 の変化に焦点を当てています。過剰発現した miR-21 の標的である FoxO1/p27 が核内に保持されるため、U87 グリオーマ細胞の増殖における変更されたエキソソーム miR-21 の役割の可能性が観察されました。
BV2由来のエキソソームは、分画遠心法を使用して取得し、細胞成分または他の小胞による汚染を防ぐためにさまざまな方法で検証しました。SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) は、BV2 細胞から抽出されたタンパク質とエクソソーム (図 1A) の間に異なるパターンを示し、サンプルはアリックスの存在について評価され、エクソソームタンパク質マーカーのウェスタンブロッティングによって分析されました。Alix 標識はエキソソームタンパク質に見られましたが、BV2 細胞溶解タンパク質には見られませんでした (図 1B)。さらに、BV2 由来のエキソソームから精製した RNA をバイオアナライザーを使用して分析しました。18S および 28S リボソーム サブユニットは、エキソソーム RNA 移動パターンでほとんど観察されず、信頼できる純度を示しています (図 1C)。最後に、透過型電子顕微鏡により、観察されたエキソソームのサイズは約60〜150 nmであり、エキソソームの形態に典型的なカップのような構造を持っていることが示されました（図1D）。
BV2 細胞由来のエキソソームの特徴付け。(A) 安全データシートのページ。タンパク質は、BV2 細胞または BV2 由来のエキソソームから分離されました。細胞とエクソソームではタンパク質のパターンが異なります。(B) エキソソーム マーカー (アリックス) の西部のしみの分析。(C) バイオアナライザーを使用した BV2 細胞および BV2 由来のエキソソームからの精製 RNA の評価。したがって、BV2細胞の18Sおよび28Sリボソームサブユニットは、エキソソームRNAにはめったに見られませんでした。(D) 透過型電子顕微鏡は、BV2 細胞から分離されたエキソソームが 2% 酢酸ウラニルでネガティブ染色されたことを示しました。エクソソームのサイズは約 60 ～ 150 nm で、カップ状です (Song and Jung、未発表データ)。
共焦点顕微鏡を使用して、BV2由来のエキソソームのU87ヒト神経膠腫細胞への細胞内在化が観察されました。PKH26 標識エキソソームは、U87 細胞の細胞質に局在しています。核はDAPIで染色され（図2A）、BV2由来のエキソソームが宿主細​​胞によって内在化され、レシピエント細胞の環境に影響を与える可能性があることを示しています。
U87グリオーマ細胞へのBV2由来エキソソームの内在化、およびトキソプラズマRHに感染したBV2由来エキソソームは、U87グリオーマ細胞の増殖を誘導した。(A) 共焦点顕微鏡で測定した U87 細胞に取り込まれたエクソソーム。U87 神経膠腫細胞は、PKH26 (赤) で標識されたエキソソームまたはコントロールなしで 24 時間インキュベートされました。核を DAPI (青) で染色し、共焦点顕微鏡 (スケールバー: 10 μm、x 3000) で観察しました。(B) U87 神経膠腫細胞の増殖は、細胞増殖アッセイによって決定されました。U87神経膠腫細胞は、示された時間エキソソームで処理されました。 *P < 0.05 はスチューデントの t 検定によって得られました。 *P < 0.05 はスチューデントの t 検定によって得られました。 *P < 0,05 получено по t-критерию Стьюдента. *スチューデントの t 検定による P < 0.05。 *P < 0.05 学生による調査で得られた。 *P < 0.05 * P < 0,05, 平均値は 100% 未満です. * スチューデントの t 検定を使用して得られた P < 0.05。
BV2由来のエキソソームのU87神経膠腫細胞への内在化を確認した後、細胞増殖アッセイを実施して、ヒト神経膠腫細胞の発生におけるBV2由来のトキソプラズマ由来のエキソソームの役割を調査しました。T. gondii 感染 BV2 細胞由来のエキソソームによる U87 細胞の処理は、T. gondii 感染 BV2 由来のエキソソームが、対照と比較して U87 細胞の有意に高い増殖を引き起こすことを示しました (図 2B)。
さらに、トキソプラズマ刺激エキソソームが最高レベルの増殖を引き起こしたため、U118 細胞の増殖は U87 と同じ結果でした (データは示していません)。これらのデータに基づいて、BV2由来のトキソプラズマに感染したエキソソームが神経膠腫細胞の増殖に重要な役割を果たすことを示すことができます。
トキソプラズマ感染 BV2 由来エキソソームが腫瘍発生に及ぼす影響を調べるために、U87 グリオーマ細胞を異種移植モデル用のヌードマウスに注入し、BV2 由来エキソソームまたは RH 感染 BV2 由来エキソソームを注入しました。１週間後に腫瘍が顕在化した後、５匹のマウスの各実験群を腫瘍サイズに従って分けて同じ開始点を決定し、腫瘍サイズを２２日間測定した。
U87異種移植モデルのマウスでは、22日目にBV2由来のRH感染エキソソーム群で有意に大きな腫瘍サイズと重量が観察されました（図3A、B）。一方、BV2由来のエクソソーム群とエクソソーム治療後の対照群との間で腫瘍の大きさに有意差はありませんでした。さらに、神経膠腫細胞とエキソソームを注入したマウスは、RH 感染 BV2 由来エキソソームのグループで最大の腫瘍体積を視覚的に示しました (図 3C)。これらの結果は、BV2由来のトキソプラズマ感染エキソソームがマウス腫瘍モデルで神経膠腫の増殖を誘導することを示しています。
U87異種移植マウスモデルにおけるBV2由来エキソソームの発癌(AC)。腫瘍サイズ (A) と重量 (B) は、BV2 由来の RH 感染エキソソームで処理した BALB/c ヌードマウスで有意に増加しました。BALB/c ヌードマウス (C) に、Matrigel 混合液に懸濁した 1 x 107 U87 細胞を皮下注射しました。注射の6日後、100μgのBV2由来のエキソソームをマウスで処理しました。腫瘍のサイズと重量は、指定された日と屠殺後にそれぞれ測定されました。 *P < 0.05。 *P < 0.05。 *Р < 0.05。 *P < 0.05。 *P < 0.05。 *P < 0.05。 *Р < 0.05。 *P < 0.05。
データは、免疫または腫瘍発生に関連する 37 の miRNA (16 が過剰発現、21 が低発現) が、トキソプラズマ RH 株の感染後にミクログリアで有意に変化したことを示しました (図 4A)。変更された miRNA 間の miR-21 の相対的な発現レベルは、BV2 由来のエキソソーム、BV2 および U87 細胞で処理されたエキソソームでのリアルタイム RT-PCR によって確認されました。miR-21 の発現は、トキソプラズマ ゴンディ (RH 株) に感染した BV2 細胞からのエキソソームの有意な増加を示しました (図 4B)。BV2およびU87細胞におけるmiR-21の相対発現レベルは、変更されたエキソソームの取り込み後に増加しました（図4B）。腫瘍患者およびトキソプラズマ原虫（ME49株）に感染したマウスの脳組織におけるmiR-21発現の相対レベルは、それぞれ対照よりも高かった（図4C）。これらの結果は、in vitro および in vivo で予測および確認された microRNA の発現レベルの差と相関しています。
トキソプラズマ ゴンディ (RH) に感染したミクログリアにおけるエキソソーム miP-21a-5p の発現の変化。(A) T. gondii RH 感染後の免疫または腫瘍発生に関連する siRNA の有意な変化を示します。(B) 相対的な miR-21 発現レベルは、BV2 由来のエキソソーム、BV2 処理されたエキソソーム、および U87 細胞でリアルタイム RT-PCR によって検出されました。(C) 相対的な miR-21 発現レベルは、腫瘍患者 (N = 3) およびトキソプラズマ原虫 (ME49 株) に感染したマウス (N = 3) の脳組織で見られました。 *P < 0.05 はスチューデントの t 検定によって得られました。 *P < 0.05 はスチューデントの t 検定によって得られました。 *P < 0,05 平均値は 0.00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000. *スチューデントの t 検定を使用して P < 0.05 が得られました。 *P < 0.05 学生による調査で得られた。 *P < 0.05 * P <0,05, 平均値は 0.00000000000000000000 です. * スチューデントの t 検定を使用して得られた P < 0.05。
RH に感染した BV2 細胞のエキソソームは、in vivo および in vitro で神経膠腫の増殖を引き起こしました（図 2、3）。関連するmRNAを検出するために、BV2またはRH BV2に由来するエキソソームに感染したU87細胞で、抗腫瘍標的遺伝子、フォークヘッドボックスO1（FoxO1）、PTEN、およびプログラム細胞死4（PDCD4）のmRNAレベルを調べました。バイオインフォマティクス分析は、FoxO1、PTEN、および PDCD4 遺伝子を含むいくつかの腫瘍関連遺伝子が miR-2121,22 結合部位を有することを示しています。抗腫瘍標的遺伝子のmRNAレベルは、BV2由来のエキソソームと比較して、RH感染BV2由来のエキソソームで減少しました（図5A）。FoxO1 は、BV2 由来のエキソソームと比較して、RH に感染した BV2 由来のエキソソームでタンパク質レベルの低下を示しました (図 5B)。これらの結果に基づいて、RH に感染した BV2 由来のエキソソームが抗発癌性遺伝子をダウンレギュレートし、腫瘍増殖における役割を維持していることを確認できました。
トキソプラズマ RH 感染 BV2 由来エキソソームは、トキソプラズマ RH 感染 BV2 由来エキソソームによる U87 神経膠腫細胞の抗腫瘍遺伝子の抑制を誘導します。(A) PBS エキソソームと比較した、T. gondii RH 感染 BV2 由来のエキソソームにおける FoxO1、PTEN、および PDCD4 発現のリアルタイム PCR。β-アクチンmRNAを対照として使用した。(B) FoxO1 式は西部のしみが付くことによって決定され、デンシトメトリー データは、ImageJ プログラムを使用して統計的に評価されました。 *P < 0.05 はスチューデントの t 検定によって得られました。 *P < 0.05 はスチューデントの t 検定によって得られました。 *P < 0,05 平均値は 0.00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000. *スチューデントの t 検定を使用して P < 0.05 が得られました。 *P < 0.05 学生による調査で得られた。 *P < 0.05 * P <0,05, 平均値は 0.00000000000000000000 です. * スチューデントの t 検定を使用して得られた P < 0.05。
腫瘍関連遺伝子調節に対するエキソソーム中の miP-21 の効果を理解するために、Lipofectamine 2000 を使用して U87 細胞に miP-21 の阻害剤をトランスフェクトし、トランスフェクションの 24 時間後に細胞を回収しました。miR-21阻害剤をトランスフェクトした細胞におけるFoxO1およびp27の発現レベルを、qRT-PCRを使用してBV2由来のエキソソームで処理した細胞と比較しました（図6A、B）。U87細胞へのmiR-21阻害剤のトランスフェクションは、FoxO1およびp27の発現を有意にダウンレギュレートした(図6)。
RH 感染エキソソーム BV2 由来の miP-21 は、U87 神経膠腫細胞における FoxO1/p27 発現を変化させました。リポフェクタミン 2000 を使用して U87 細胞に miP-21 阻害剤をトランスフェクトし、トランスフェクションの 24 時間後に細胞を回収しました。miR-21阻害剤をトランスフェクトした細胞のFoxO1およびp27の発現レベルを、qRT-PCRを使用してBV2由来のエキソソームで処理した細胞のレベルと比較しました(A、B)。
宿主の免疫反応から逃れるために、トキソプラズマ原虫は組織嚢胞に変化します。それらは、宿主の生涯を通じて、脳、心臓、骨格筋などのさまざまな組織に寄生し、宿主の免疫応答を調節します。さらに、それらは宿主細胞の細胞周期とアポトーシスを調節し、その増殖を促進することができます14,24。トキソプラズマ原虫は、主に宿主の樹状細胞、好中球、および脳ミクログリアを含む単球/マクロファージ系統に感染します。トキソ プラズマ原虫は、M2 表現型のマクロファージの分化を誘導し、病原体感染後の創傷治癒に影響を与え、血管新生や肉芽腫性線維症とも関連しています。このトキソプラズマ感染の行動的病因は、腫瘍発生に関連するマーカーに関連している可能性があります。トキソプラズマによって規制される敵対的な環境は、対応する前がんに似ている可能性があります。したがって、トキソプラズマ感染が脳腫瘍の発生に寄与していると推測できます。実際、さまざまな脳腫瘍患者の血清でトキソプラズマ感染率が高いことが報告されています。さらに、トキソプラズマ原虫は別の発がん性エフェクターである可能性があり、相乗的に作用して他の感染性発がん物質が脳腫瘍を発症するのを助けます.この点で、熱帯熱マラリア原虫とエプスタイン-バーウイルスが相乗的にバーキットリンパ腫の形成に寄与していることは注目に値します。
がん研究の分野における調節因子としてのエキソソームの役割は、広く調査されています。ただし、寄生虫と感染した宿主の間のエキソソームの役割はよくわかっていません。これまでのところ、分泌タンパク質を含むさまざまな調節因子によって、原虫寄生虫が宿主の攻撃に抵抗し、感染を永続させる生物学的プロセスが説明されています。最近、原生動物に関連する微小胞とそのマイクロRNAが宿主細胞と相互作用して、宿主細胞の生存に有利な環境を作り出すという概念が高まっています。したがって、変更されたエキソソーム miRNA と神経膠腫細胞増殖との関係を発見するには、さらなる研究が必要です。マイクロRNAの変化（クラスター遺伝子miR-30c-1、miR-125b-2、miR-23b-27b-24-1およびmiR-17-92）は、トキソプラズマ感染ヒトマクロファージのSTAT3プロモーターに結合し、調節され、抗・トキソプラズマ原虫感染に応答したアポトーシス ２９．トキソプラズマ感染は、miR-17-5p および miR-106b-5p の発現を増加させ、これらはいくつかの過剰増殖性疾患に関連しています 30 。これらのデータは、トキソ プラズマ感染によって調節される宿主の miRNAs が、宿主の生物学的行動における寄生虫の生存と病因にとって重要な分子であることを示唆しています。
変化した miRNA は、神経膠腫を含む悪性細胞の開始および進行中のさまざまなタイプの動作に影響を与える可能性があります。成長シグナルの自給自足、成長阻害シグナルに対する非感受性、アポトーシス回避、無限の複製可能性、血管新生、浸潤および転移、炎症などです。神経膠腫では、いくつかの発現プロファイリング研究で変更された miRNA が特定されています。
本研究では、トキソプラズマ感染宿主細胞における高レベルのmiRNA-21発現を確認しました。miR-21 は、神経膠腫を含む固形腫瘍で最も頻繁に過剰発現するマイクロ RNA の 1 つとして同定されており 33、その発現は神経膠腫のグレードと相関しています。蓄積された証拠は、miR-21 が神経膠腫の増殖における抗アポトーシス因子として作用する新規の癌遺伝子であり、ヒト脳悪性腫瘍の組織および血漿で高度に過剰発現していることを示唆しています。興味深いことに、神経膠腫細胞および組織におけるmiR-21の不活性化は、カスパーゼ依存性アポトーシスによる細胞増殖の阻害を引き起こします。miR-21 予測標的のバイオインフォマティクス分析により、プログラム細胞死 4 (PDCD4)、トロポミオシン (TPM1)、PTEN、およびフォークヘッド ボックス O1 (FoxO1) を含むアポトーシス経路に関連する複数の腫瘍抑制遺伝子が miR-2121 結合部位とともに明らかになった。.22.38.
FoxO1 は、転写因子 (FoxO) の 1 つとして、さまざまな種類のヒトがんの発生に関与しており、p21、p27、Bim、FasL40 などの腫瘍抑制遺伝子の発現を調節できます。FoxO1 は、p27 などの細胞周期阻害剤に結合して活性化し、細胞増殖を抑制することができます。さらに、FoxO1 は PI3K/Akt シグナル伝達の主要なエフェクターであり、p2742 転写の活性化による細胞周期の進行や細胞分化などの多くの生物学的プロセスを調節します。
結論として、トキソプラズマ感染ミクログリア由来のエキソソーム miR-21 は、神経膠腫細胞の成長調節因子として重要な役割を果たしている可能性があると考えています (図 7)。ただし、エキソソーム miR-21、変化したトキソプラズマ感染、および神経膠腫の成長の間の直接的な関連性を見つけるには、さらなる研究が必要です。これらの結果は、トキソプラズマ感染と神経膠腫の発生率との関係を研究するための出発点を提供することが期待されています。
この研究では、神経膠腫（脳）発がんのメカニズムの模式図が提案されています。著者は PowerPoint 2019 (マイクロソフト、ワシントン州レドモンド) で描画します。
動物の使用を含む、この研究におけるすべての実験プロトコルは、ソウル国立大学動物管理およびユーザー委員会の標準倫理ガイドラインに従っており、ソウル国立大学医学部の治験審査委員会によって承認されました (IRB 番号 SNU- 150715)。-2)。すべての実験手順は、ARRIVE の推奨に従って実行されました。
BV2 マウス ミクログリアおよび U87 ヒト グリオーマ細胞は、それぞれ 10% ウシ胎児血清、4 mM l-グルタミン、0.2 mM ペニシリンおよび 0.05 mM ストレプトマイシン。細胞は、5% CO2、37°C​​ のインキュベーターで培養しました。別の神経膠腫細胞株である U118 を使用して、U87 細胞と比較しました。
T. gondii に感染した RH および ME49 株からエキソソームを分離するために、T. gondii タキゾイト (RH 株) を 3 ～ 4 日前に注射した 6 週齢の BALB/c マウスの腹腔から採取しました。タキゾイトを PBS で 3 回洗浄し、40% Percoll (Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国) で遠心分離により精製しました 43。ＭＥ４９株のタキゾイトを得るために、ＢＡＬＢ／ｃマウスに２０個の組織嚢胞を腹腔内注射し、嚢胞中のタキゾイト形質転換を、感染後（ＰＩ）６～８日目に腹腔を洗浄することによって収集した。PBSに感染したマウス。ME49 タキゾイトは、100 μg/ml ペニシリン (Gibco/BRL, Grand Island, NY, USA)、100 μg/ml ストレプトマイシン (Gibco/BRL)、および 5% ウシ胎児血清 (Lonza, Walkersville, MD) を添加した細胞で増殖させました。 .., USA) 37 °C および 5% 二酸化炭素で。Vero 細胞で培養した後、ME49 タキゾイトを 25 ゲージ針に 2 回通し、次に 5 μm フィルターに通して破片と細胞を除去しました。洗浄後、タキゾイトをＰＢＳ４４に再懸濁した。トキソプラズマ・ゴンディＭＥ４９株の組織嚢胞は、感染したＣ５７ＢＬ／６マウスの脳から単離された嚢胞の腹腔内注射によって維持された（Ｏｒｉｅｎｔ Ｂｉｏ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ、城南、韓国）。ME49 感染マウスの脳は PI の 3 ヶ月後に収穫され、嚢胞を分離するために顕微鏡下でミンチされました。感染したマウスは、ソウル国立大学医学部で特別な無菌状態 (SPF) で飼育されました。
溶出ステップのインキュベーション時間を含む製造元の指示に従って、miRNeasy Mini Kit (Qiagen、ヒルデン、ドイツ) を使用して、BV2 由来のエキソソーム、BV2 細胞、および組織から全 RNA を抽出しました。RNA 濃度は、NanoDrop 2000 分光光度計で測定しました。RNAマイクロアレイの品質は、Agilent 2100バイオアナライザー（Agilent Technologies、アムステルフェーン、オランダ）を使用して評価されました。
10% エキソソームの少ない FBS を含む DMEM は、100,000 g で 16 時間、4 °C で超遠心分離することによって調製し、0.22 µm フィルター (Nalgene、Rochester、NY、USA) でろ過しました。5 × 105 個の BV2 細胞を、10% エキソソーム除去 FBS および 1% 抗生物質を含む DMEM で、37°C​​、5% CO2 で培養しました。24 時間のインキュベーション後、RH または ME49 株のタキゾイト (MOI = 10) を細胞に添加し、非侵入性寄生虫を 1 時間以内に除去し、DMEM を再充填しました。BV2細胞からのエキソソームは、最も広く使用されている方法である修正分画遠心法によって分離されました。RNA またはタンパク質分析用に 300 µl の PBS でエキソソーム ペレットを再懸濁します。分離されたエキソソームの濃度は、BCAタンパク質アッセイキット（Pierce、Rockford、IL、USA）およびNanoDrop 2000分光光度計を使用して決定されました。
BV2 細胞からの沈殿物または BV2 由来のエキソソームを PRO-PREP™ タンパク質抽出溶液 (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Korea) で溶解し、タンパク質をクーマシー ブリリアント ブルーで染色した 10% SDS ポリアクリルアミド ゲルにロードしました。さらに、タンパク質を PVDF 膜に 2 時間転写しました。ウエスタンブロットは、エキソソームマーカーとしてAlix抗体（Cell Signaling Technology、ビバリー、マサチューセッツ州、米国）を使用して検証されました。HRP結合ヤギ抗マウスIgG（H + L）（Bethyl Laboratories、モンゴメリー、テキサス州、米国）およびLAS-1000プラス発光イメージアナライザー（富士写真フィルム、東京、日本）を二次抗体として使用しました。.エキソソームのサイズと形態を研究するために、透過型電子顕微鏡法が実施されました。BV2 細胞から分離されたエキソソーム (6.40 μg/μl) は、カーボンコーティングされたメッシュ上で調製され、2% 酢酸ウラニルで 1 分間ネガティブ染色されました。準備されたサンプルは、ES1000W Erlangshen CCDカメラ（Gatan、Pleasanton、CA、USA）を搭載したJEOL 1200-EX II（東京、日本）を使用して、80 kVの加速電圧で観察されました。
BV2 由来のエキソソームは、PKH26 Red Fluorescent Linker Kit (Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国) を使用して、室温で 15 分間染色しました。U87細胞、2×105、PKH26標識エキソソーム（赤）または陰性対照としてエキソソームなしを5％CO2インキュベーターで37℃で24時間インキュベートしました。U87 細胞核を DAPI (青) で染色し、U87 細胞を 4% パラホルムアルデヒドで 4°C で 15 分間固定し、ライカ TCS SP8 STED CW 共焦点顕微鏡システム (ライカ マイクロシステムズ、マンハイム、ドイツ) で分析しました。観測可能。
Mir-X siRNAファーストストランド合成およびSYBR qRT-PCRキット（タカラバイオ株式会社、滋賀、日本）を使用して、siRNAからcDNAを合成した。リアルタイム定量的 PCR は、SYBR Premix と混合したプライマーとテンプレートを使用して、iQ5 リアルタイム PCR 検出システム (Bio-Rad、Hercules、CA、USA) を使用して実行されました。DNA は、95°C で 15 秒間の変性と 60°C で 60 秒間のアニーリングの 40 サイクルで増幅されました。各 PCR 反応からのデータは、iQ™5 光学システム ソフトウェア (Bio-Rad) のデータ分析モジュールを使用して分析されました。選択した標的遺伝子とβ-アクチン/siRNA(およびU6)の間の遺伝子発現の相対的変化は、標準曲線法を使用して計算されました。使用したプライマー シーケンスを表 1に示します。
3 x 104 個の U87 神経膠腫細胞を 96 ウェルプレートに播種し、12、18、および 36 時間の時点で、BV2 由来のトキソプラズマ感染エキソソーム (50 μg/mL) または BV2 由来の非パルスエキソソーム (50 μg/mL) と混合しました。 .細胞増殖率は、Cell Counting Kit-8 (同仁堂、熊本、日本) を使用して決定した (補足図 S1-S3) 46 。
5 週齢のメスの BALB/c ヌードマウスを Orient Bio (城南市、韓国) から購入し、室温 (22±2°C) および湿度 (45±15°C) の無菌ケージに個別に保管しました。%) 室温 (22±2°C) および湿度 (45±15%) で。12 時間の明サイクルと 12 時間の暗サイクルを SPF (Seoul National University School of Medicine Animal Center) の下で実行しました。マウスをそれぞれ 5 匹ずつの 3 つのグループに無作為に分け、すべてのグループに 1 x 107 U87 グリオーマ細胞と成長因子を減少させた BD マトリゲル (BD Science、フロリダ州マイアミ) を含む 400 ml の PBS を皮下注射しました。腫瘍注射の6日後、BV2細胞由来のエキソソーム200mg(トキソプラズマ感染あり/なし)を腫瘍部位に注射した。腫瘍感染の２２日後、各群のマウスの腫瘍サイズを週３回ノギスで測定し、０．５×（幅）×２×長さの式により腫瘍体積を計算した。
miRCURYTM LNA miRNA アレイ、第 7 世代 has、mmu および rno アレイ (EXIQON、Vedbaek、デンマーク) を使用したマイクロ RNA 発現分析は、3100 のヒト、マウス、およびラット miRNA キャプチャープローブのうち 1119 の十分に特徴付けられたマウスをカバーしています。この手順の間、250～1000 ng の全 RNA を子ウシ腸アルカリホスファターゼで処理し、続いて Hy3 緑色蛍光色素で標識することにより、5'-リン酸から除去しました。次に、ハイブリダイゼーションチャンバーキット（Agilent Technologies、カリフォルニア州サンタクララ）およびハイブリダイゼーションスライドキット（Agilent Technologies）を使用してマイクロアレイスライドをロードすることにより、標識されたサンプルをハイブリダイズさせました。ハイブリダイゼーションは 56℃で 16 時間行い、その後マイクロアレイをメーカーの推奨に従って洗浄しました。次いで、処理されたマイクロアレイスライドを、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇ２５６５ＣＡマイクロアレイスキャナーシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してスキャンした。スキャンされた画像は、Agilent Feature Extraction ソフトウェア バージョン 10.7.3.1 (Agilent Technologies) を使用してインポートされ、各画像の蛍光強度は、修正された Exiqon プロトコルの対応する GAL ファイルを使用して定量化されました。現在の研究のマイクロアレイ データは、受託番号 GPL32397 で GEO データベースに登録されています。
トキソプラズマに感染したRHまたはME49株のミクログリアにおける成熟エキソソームmiRNAの発現プロファイルは、さまざまなネットワークツールを使用して分析されました。腫瘍発生に関連する miRNA は、miRWalk2.0 (//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) を使用して特定され、8.0 を超える正規化されたシグナル強度 (log2) でフィルター処理されました。T. gondii に感染した RH または ME49 株によって変更された miRNA のフィルター分析により、miRNA の中で、差次的に発現する miRNA が 1.5 倍以上変更されていることがわかりました。
細胞は、Lipofectamine 2000 (Invitrogen、Carlsbad、CA、USA) を使用して、opti-MEM (Gibco、Carlsbad、CA、USA) の 6 ウェル プレート (3 x 105 細胞/ウェル) に播種しました。トランスフェクトされた細胞を６時間培養した後、培地を新鮮な完全培地に交換した。トランスフェクションの24時間後に細胞を回収した。
統計分析は主に、Excel ソフトウェア (Microsoft、米国ワシントン DC) を使用したスチューデントの t 検定を使用して実行されました。実験動物の分析では、Prism 3.0 ソフトウェア (GraphPad Software、La Jolla、CA、USA) を使用して双方向 ANOVA を実行しました。 P 値 < 0.05 は、統計的に有意と見なされました。 P 値 < 0.05 は、統計的に有意と見なされました。 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. P値<0.05は、統計的に有意であると見なされました。 P 値 < 0.05 は、科学的な意味があると見なされます。 P 值< 0.05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. P値<0.05は、統計的に有意であると見なされました。
この研究で使用されたすべての実験プロトコルは、ソウル国立大学医学部の機関審査委員会によって承認されました (IRB 番号 SNU-150715-2)。
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
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Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS 脳腫瘍の危険因子とその治療的介入に関する洞察。 Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS 脳腫瘍の危険因子とその治療的介入に関する洞察。Rashid、S.、Rehman、K.およびAkash、MS 脳腫瘍および主要な治療的介入の危険因子のレビュー。 Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS は、腫瘍の危険因子とその治療の乾燥対策に深く関わっています。 Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS 脳腫瘍の危険因子と治療的介入に関する深い理解。Rashid、S.、Rehman、K.およびAkash、MS 脳腫瘍および主要な治療的介入の危険因子のレビュー。生物医学。薬剤師。143、112119 (2021)。
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Magon, KL & Parish, JL 感染から癌へ: DNA腫瘍ウイルスが宿主細胞の中心炭素および脂質代謝をどのように変化させるか. Magon, KL & Parish, JL 感染から癌へ: DNA腫瘍ウイルスが宿主細胞の中心炭素および脂質代謝をどのように変化させるか.Mahon, KL および Parish, JL がんへの火の感染: DNA ベースの腫瘍ウイルスが宿主細胞の中心炭素および脂質代謝をどのように変化させるか。 Magon, KL および Parish, JL は、感染から癌まで：DNA 腫瘍ウイルスは宿主細胞の中心炭素および脂質置換をどのように変化させるか。 Magon, KL & Parish, JL 感染から癌へ: DNA腫瘍ウイルスが宿主細胞の中心炭素および脂質代謝をどのように変化させるか.Mahon, KL および Parish, JL が癌への感染を引き起こす: DNA 腫瘍ウイルスが宿主細胞の中心的な炭素および脂質代謝をどのように変化させるか。生物学を開きます。11, 210004 (2021).
コレイア・ダ・コスタ、JM 他住血吸虫および肝吸虫のカテコールエストロゲンおよび蠕虫関連癌。フロント。中は暑い。5、444（2014）。