十二指腸ジアルジアは、下痢の臨床症状を伴う幼児に特に一般的な腸感染症であるジアルジア症を引き起こす寄生生物です。我々は以前、細胞外G.十二指腸リスが細胞内オリゴマー化様受容体3（NLRP3）結合ヌクレオチドの活性化を引き起こし、細胞外小胞（EV）分泌を通じて宿主の炎症反応を調節することを報告した。しかし、このプロセスに関与する病原体関連十二指腸球菌EV（GEV）の正確な分子パターンと、ジアルジア症におけるNLRP3インフラマソームの役割はまだ解明されていない。
GEV 内の組換え真核生物発現プラスミド pcDNA3.1(+)-alpha-2 および alpha-7.3 giardin を構築し、マウス初代腹膜マクロファージにトランスフェクトし、炎症標的分子カスパーゼ 1 を測定することによって検出しました。p20発現レベルをスクリーニングした。。G. デュオデナリス アルファ-2 およびアルファ-7.3 ジャルジンは、もともと NLRP3 インフラマソーム (NLRP3、プロインターロイキン 1 ベータ [IL-1β]、プロカスパーゼ 1 およびカスパーゼ 1 p20)、IL 分泌を測定することによって同定されました。1β レベル、アポトーシススポットタンパク質 (ASC) オリゴマー化レベル、および NLRP3 と ASC の免疫蛍光局在。次に、G.十二指腸リスの病原性におけるNLRP3インフラマソームの役割を、NLRP3活性化がブロックされたマウス(NLRP3ブロックマウス)を使用して評価し、体重、十二指腸寄生虫負荷、および十二指腸組織の病理学的変化をモニタリングした。さらに、ヒアルジンα-2およびα-7.3がNLRP3インフラマソームを介して生体内でIL-1β分泌を誘導するかどうかを調査し、マウスにおけるG.十二指腸リスの病原性におけるこれらの分子の役割を決定した。
アルファ-2 およびアルファ-7.3 ジャルジンは、インビトロで NLRP3 インフラマソームの活性化を誘導します。これにより、p20 カスパーゼ-1 の活性化、NLRP3、プロ IL-1β、およびプロカスパーゼ-1 タンパク質の発現レベルの増加、IL-1β 分泌の大幅な増加、組織内の ASA スポットの形成が引き起こされました。細胞質、および ASA オリゴマー化の誘導。NLRP3 炎症 陰茎の喪失により、マウスにおける G. 十二指腸リスの病原性が悪化します。NLRP3ブロックマウスから強制経口投与により嚢胞を投与したマウスは、栄養型の数が増加し、収縮して分枝した壊死性陰窩を特徴とする十二指腸絨毛への重篤な損傷を示した。in vivo 実験では、ジャルジン アルファ-2 およびアルファ-7.3 が NLRP3 インフラマソームを介して IL-1β の分泌を誘導できることが示されており、ジャルジン アルファ-2 およびアルファ-7.3 による免疫化によりマウスにおける G. 十二指腸リスの病原性が減少しました。
総合すると、この研究の結果は、ジアルジア症α-2とα-7.3がマウスの宿主NLRP3炎症の上方制御を引き起こし、ジアルジア症予防の有望な標的であるG.十二指腸リスの感染力を低下させることを示唆している。
十二指腸ジアルジアは小腸に生息する細胞外寄生原虫で、特に発展途上国の幼児の間で毎年 2 億 8,000 万件の下痢を伴うジアルジア症を引き起こしています [1]。十二指腸結核嚢胞で汚染された飲料水や食べ物によって人は感染し、十二指腸嚢胞は胃に入り、胃液中に排泄されます。十二指腸ジアルジアの栄養型は十二指腸上皮に付着し、吐き気、嘔吐、下痢、腹痛、体重減少を引き起こします。免疫不全症や嚢胞性線維症のある人は感染しやすいです。オーラルセックスやアナルセックスを通じて感染することもあります[2]。メトロニダゾール、チニダゾール、ニタゾキサニドなどの薬剤は、十二指腸感染症の好ましい治療選択肢です[3]。しかし、これらの化学療法薬は吐き気、発がん、遺伝毒性などの有害な副作用を引き起こします[4]。したがって、G. 十二指腸リス感染を防ぐためには、より効果的な戦略を開発する必要があります。
インフラマソームは、自然免疫応答の一部であるサイトゾルタンパク質複合体の一種であり、病原体の侵入に対する防御と炎症反応の媒介に役立ちます [5]。これらのインフラマソームのうち、ヌクレオチド結合オリゴマー化 (NOD) 受容体 3 (NLRP3) ヌクレオチド結合オリゴマー化 (NLRP3) ヌクレオチド結合様インフラマソームは、さまざまな病原体/損傷関連分子パターン (PAMP/ DAMP) を認識し、自然免疫系を活性化します。そして多くの炎症性疾患において腸の恒常性を調節します[6、7、8]。これは、パターン認識受容体 (PRR) NLRP3、アダプター アポトーシス スポット タンパク質 (ASC)、およびエフェクター プロカスパーゼ-1 またはプロカスパーゼ-11 で構成されます。NLRP3 インフラマソームは、ネオスポラ カニナム [9]、パラコクシジオイデス ブラジリエンシス [10]、リーシュマニアの研究で観察されているように、病原体の侵入に対する宿主として機能します。[11]、しかし、NLRP3 インフラマソームの活性化が防御免疫反応を制限し、たとえば線虫などの病気の進行を悪化させることも報告されています [12]。我々の以前の発見に基づいて、細胞外G.十二指腸リスがNLRP3炎症の細胞内活性化を引き起こし、細胞外小胞（EV）を分泌することによって宿主の炎症反応を調節することを報告しました[13]。しかし、生体内での G. 十二指腸リス感染における NLRP3 インフラマソームの役割はまだ解明されていません。
ジャルジンはもともと G. 十二指腸リスの細胞骨格の構造成分として記載されており、小腸における栄養型の運動性と上皮細胞の付着において重要な役割を果たしています。環境への適応を改善し、病原性を高めるために、G. デュオデナリス トロフォゾイトは、8 本の鞭毛、1 つの中間体、および 1 つの腹側板からなる独特の細胞骨格構造を発達させました [14]。十二指腸ジアルジアの栄養型は、細胞骨格を使用して小腸上部、特に十二指腸に侵入し、腸細胞に付着します。それらは常に移動し、細胞代謝を利用して上皮細胞に付着します。したがって、それらの細胞骨格と病原性の間には密接な関係があります。十二指腸ジアルジアに特異的なジャルジンは細胞骨格構造の構成要素であり [15]、α-、β-、γ-、δ-ジャルジンの 4 つのクラスに分類されます。α-giardin ファミリーには 21 のメンバーがあり、そのすべてがカルシウム依存的にリン脂質に結合する能力を持っています [16]。また、細胞骨格を細胞膜に接続します。G. 十二指腸リスによって引き起こされる下痢を患っている人では、感染中にα-ジャルジンが高度に発現され、免疫反応性が高くなります[17]。ジアルジア アルファ-1 に基づく異種ワクチンは、マウスのジアルジア症を防御し、ワクチン開発の潜在的な候補抗原です [18]。α-8 ジャルジンは原形質膜と鞭毛に局在しているが、腹側椎間板には局在しておらず、G. 十二指腸リスの栄養型の運動性と成長速度を高めます [19]。アルファ-14 ジャルジンは鞭毛の微小管構造に付着し、G. 十二指腸リスの生存率に影響を与えます [20]。アルファ-11 ジアルジンは生活環を通じて豊富に存在し、アルファ-11 ジャルジンの過剰発現は G. 十二指腸自体に損傷を与えます [21]。しかし、α-2 ジアルジンとα-7.3 ジアルジンが G. 十二指腸リス感染を防御するかどうか、およびその根底にあるメカニズムは不明です。
この研究では、組換え真核生物発現プラスミド pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine および pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine をマウス初代腹腔マクロファージにトランスフェクトし、宿主 NLRP3 を活性化しました。次に、インフラマソーム標的をスクリーニングした。また、G. 十二指腸リスの病原性における NLRP3 インフラマソームの役割を評価し、α-2 およびα-7,3 ジアルジンが in vivo で NLRP3 インフラマソームの活性化を誘導するかどうかを調査し、ジアルジンの病原性におけるこれら 2 つのジャルジンの役割を決定しました。 G.十二指腸。私たちの共通の目標は、G.十二指腸感染症の予防のための有望な標的を開発することでした。
野生型（WT）C57BL/6 雌マウス（生後 5 ～ 8 週齢）を、遼寧省長生実験動物センター（中国、遼寧省）から購入しました。マウスには水を自由に摂取させ、滅菌餌を与え、12/12時間の明暗サイクルで飼育した。感染前に、マウスにはアンピシリン (1 mg/mL)、バンコマイシン (1 mg/mL)、およびネオマイシン (1.4 mg/mL) (すべて中国の上海から購入、人工生物) を補充した飲料水に抗生物質を自由に摂取させました [22] ]。]。24 時間以上飲食能力を失い、体重が 20% 以上減少したマウスは、頸椎脱臼により人道的に安楽死させられました。
WB G.十二指腸栄養型（American Type Culture Collection、米国マナッサス）に12.5％ウシ胎児血清（FBS、Every Green、浙江省、中国）および0.1％ウシ胆汁（Sigma-Aldrich、セントミズーリ州、米国）を補充しました。 ）。米国）微好気条件下で。コンフルエントな栄養型を氷上で収集し、さらに増殖させるために 1:4 の比率で継代しました。
以前に記載されているように十二指腸ジアルジア嚢胞を誘導し[23]、栄養型を対数増殖期で収集し、カプセル化誘導培地、pH 7.1 (改変 TYI-S-33) で最終濃度 1 × 106 栄養型/mL まで希釈しました。胆汁濃度0.05％中）。栄養型は37℃の嫌気条件下で対数増殖期まで培養した。培地を嚢胞誘導培地（pH 7.8、胆汁濃度 1% の改変 TYI-S-33 培地）に交換し、G.十二指腸リスを 37℃で 48 ～ 96 時間培養し、その間に形成される嚢胞を顕微鏡で観察します。ほとんどの栄養型がシストの形成を誘導された後、培養混合物を採取し、滅菌脱イオン水に再懸濁して、残りの栄養型を溶解させた。嚢胞を計数し、マウスの胃管を通したその後の分析のために 4℃ で保存しました。
ジアルジア細胞外小胞 (GEV) は、以前に記載されているように濃縮されました [13]。対数増殖期の栄養型を、エキソソーム除去 FBS (Biological Industries, Beit-Haemek, Israel) で最終濃度 1 × 106 寄生虫/mL になるように調製した改変 TYI-S-33 培地に再懸濁し、12 時間インキュベートしました。２０００ｇで１０分間、１０，０００ｇで４５分間、および１００，０００ｇで６０分間の遠心分離によって培養上清から単離した。沈殿をリン酸緩衝食塩水（PBS）に溶解し、BCAタンパク質アッセイキット（Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA、USA）を使用して定量し、-80℃で保存するか、またはさらなる分析に直接使用しました。
初代マウス腹膜マクロファージは、以前に記載されているように調製されました[24]。簡単に説明すると、マウス（6〜8週齢）に2.98％Difco液体チオグリコール培地（BD、米国ニュージャージー州フランクリンレイクス）2.5mlを（腹腔内［ip］）注射し、3〜4口蓋に給餌した。マクロファージの懸濁液を安楽死後のマウスの腹腔から収集し、1000gで10分間3回遠心分離した。採取した細胞を、細胞純度が98%を超えるまでCD11bマーカーを使用するフローサイトメトリーで検出し、その後6ウェル細胞培養プレート(4.5×106細胞/ウェル)に加え、10% FBS (Bioindustry)とともに37℃でインキュベートしました。そして5%のCO2。
1 mlのTRIzol試薬（Vazyme、中国、南京）中の1×107個の栄養体からRNAを抽出し、MonScript dsDNase（Monad、武漢、中国）を使用してG.十二指腸リスの全RNAからゲノムDNAを抽出し、相補的DNA（cDNA）を合成しました。製造元の指示に従って、MonScript RTIIII Super Mix (Monad) を使用します。
標的 G. デュオデナリス遺伝子の CDS 配列情報は、NCBI GenBank から取得しました。Primer 5.0 を使用して、ターゲット遺伝子ごとに特定のシームレスなクローニング プライマーを設計します。フォワードプライマー (5'-3') は 3 つの部分で構成されます: 直線化ベクター pcDNA3.1(+) EcoRV (TGTGGGAATTCTGCAGAT) との重複配列、および開始コドン ATG および GNN (最初の塩基が G でない場合)。これは、式の効率を向上させるために行われます。さらに、少なくとも 16 bp の結合塩基 (GC 含量 40 ～ 60%/Tm 約 55 °C)。リバースプライマー (5'-3') は、EcoRV 直線化ベクター pcDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) と重複する配列と少なくとも 16 bp の結合塩基の 2 つの部分から構成されます。（最後の2つの停留所を除く）。塩基）組換えプラスミドが標識タンパク質を発現できるようにするAAまたはGAなどのコドン）。プライマー配列を表 1 に示します。これらは Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (長春、中国) によって合成されました。
標的は、準備された G. 十二指腸 cDNA を鋳型として使用し、Pfu DNA ポリメラーゼ (Tiangen、北京、中国) または Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd.、北京、中国) を使用して増幅されました。真核生物発現ベクター プラスミド pcDNA3.1(+) を制限酵素 EcoRV で直線化し、Fast AP (Thermo Fisher Scientific) を使用して脱リン酸化しました。線状化したpcDNA3.1(+)フラグメントおよび増幅された標的遺伝子フラグメントを、DNAゲル精製キット(Tiangen)を使用して精製し、Nanodrop ND-2000(Thermo Fisher Scientific)を使用して定量した。pcDNA3.1(+) フラグメントと各標的遺伝子フラグメントを、MonClone シングル アセンブリ クローニング ミックス (Monad Biotech Co., Ltd.、蘇州、中国) を使用して再結合し、Comate Bioscience Company Limited (長春、中国) を使用した DNA シークエンシングによって確認しました。。
エンドトキシンフリー プラスミド pcDNA3.1(+)-alpha-2 および pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 は、SanPrep Endotoxin-free Plasmid Mini Kit (Sangon Biotech) を使用して生成しました。溶出バッファー中の EDTA がトランスフェクションアッセイに干渉しないように、濃度を 500 ng/μl 以上に維持しました。初代マウス腹膜マクロファージを完全RPMI 1640培地（Biological Industries）を含む6ウェルプレートで12時間培養し、その後細胞を温PBSで3回洗浄してペニシリンとストレプトマイシンを除去し、その後完全培地を補充した培地で洗浄しました。エンドトキシンフリーのプラスミドpcDNA3.1(+)-alpha-2およびpcDNA3.1(+)-alpha-7.3（2.5μg）を125μlのOpti-MEM低減血清培地（Gibco、Thermo Fisher Scientific）で希釈した。。次に、リポフェクタミン 2000 トランスフェクション試薬 (Invitrogen、Thermo Fisher Scientific) 5 μl を低血清 Opti-MEM 培地 125 μl で希釈しました。希釈したエンドトキシンフリープラスミドをリポフェクタミン 2000 と混合し、混合物を室温で 5 分間放置することにより、リポソーム - DNA 複合体を調製します。複合体を各ウェルの細胞に別々に移し、ゆっくりと混合します。４時間後、細胞培養培地を２ｍｌの完全ＲＰＭＩ １６４０培地と交換し、培養を２４時間継続した。新鮮な細胞培養培地を細胞に添加し、アッセイ設計に応じてさまざまな時点でインキュベートしました。
上清および細胞溶解物からのタンパク質サンプルは、以前に記載されているように調製されました[25]。プロ IL-1β、プロカスパーゼ-1、カスパーゼ-1 p20、NLRP3、β-アクチン、および His-tag の膜移動パラメーターは 200 mA/90 分でした。インターロイキン 1β (IL-1β; R&D Systems、ミネソタ州ミネアポリス)、カスパーゼ-1 (p20) (スイス、アディポジェン)、および NLRP3 (スイス、エパリンゲス、アディポジェン SA)、および His タグをターゲットとする 1:5000 (Amylet Scientific、武漢、中国）およびβ-アクチン（プロテインテック、中国武漢）。
ジスクシンイミド スベレート (DSS) による架橋は、以前に記載されているように実行されました [26]。細胞を冷ＰＢＳで３回洗浄し、２５ｍＭ Ｎａ２ＰＯ４、１８７．５ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび１２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３を含む５０μｌのＡＳＣ反応緩衝液（ｐＨ８．０）中で２７ゲージ針を用いて完全に溶解した。混合物を５０００ｇで３分間遠心分離し、ペレットを１０μｌのＤＳＳ（ＤＭＳＯ中２５ｍＭ）および４０μｌのＡＳＣ反応緩衝液で３７℃で３０分間縫合した。5000gで10分間遠心分離した後、ペレットを40μlのASC反応緩衝液および10μlの6×タンパク質ローディング緩衝液（TransGen、北京、中国）の溶液に溶解し、次いで溶液を室温で15分間急冷した。分。, その後10分ほど茹でます。次に、タンパク質サンプルを、1:500 の希釈率で一次抗 ASC 抗体 (Wanleibio、瀋陽、中国) を使用してウェスタンブロッティングに供しました。
以前に記載された手順 [13] に従って、細胞培養上清を採取し、マウス IL-1 ベータ ELISA キット (Invitrogen、Thermo Fisher Scientific) を使用して炎症誘発性サイトカイン IL-1β の分泌を測定しました。IL-1β標準曲線を使用して、OD450nm値をタンパク質濃度に変換します。
カバースリップ上にコーティングされた細胞を温 PBS で 3 回穏やかに洗浄し、組織細胞固定液 (Biosharp、北京、中国) で 100 の 0.1% Triton X-Permeabilize (PBS で希釈、Biosharp) 中で室温 (RT) で 10 分間固定しました。 ）室温で２０分間ブロックし、５％ウシ血清アルブミン（ＰＢＳ中）中で室温で２時間ブロックする。次に、細胞を、ASC (1:100 希釈) または NLRP3 (1:100 希釈) に対する一次抗体、および Cy3 標識ヤギ抗ウサギ IgG(H+L) (1:400; EarthOx) それぞれとともに 4℃で一晩インキュベートしました。 、サンフランシスコ、カリフォルニア州、米国）またはFITC結合ヤギ抗マウスIgG（1：400; Earthox）を暗所で37℃で一晩、1時間静置した。核を Hoechst 33258 (10 μg/ml; UE、蘇州、中国) で 5 分間染色し、蛍光顕微鏡 (オリンパス株式会社、東京、日本) で観察しました。
マウスを４つのグループに分けた（各グループｎ＝７）：（ｉ）ＰＢＳ処理陰性対照グループ（ＰＢＳのみ；１００μｌ／マウスのＰＢＳを強制経口投与し、その後３時間後に毎日１００μｌ／マウスのＰＢＳを腹腔内注射）。、7日間継続して）。(ii) MCC950 阻害剤 [27] で治療した陰性対照群 (PBS 強制経口投与により 100 μl/マウス、3 時間後、10 mg/kg 体重 [BW] MCC950 [PBS 中] を毎日腹腔内投与、期間 7 日間)。(iii) G.十二指腸リス嚢胞感染群(胃管栄養法により1.5×106個の嚢胞/マウス、3時間後、100μl/マウスのPBSを7日間毎日腹腔内投与)。（ｉｖ）Ｇ．十二指腸嚢胞複合感染群ＭＣＣ９５０阻害剤治療群（胃管栄養法により１．５×１０ ６ 個の嚢胞／マウス、１０ｍｇ／ｋｇ体重のＭＣＣ９５０を毎日７日間、３時間に腹腔内投与）。各マウスの体重を毎日監視し、7日目にすべてのマウスを安楽死させた。採取した十二指腸(長さ3cm)を1mlのPBS中で小片に切断し、嚢胞をPBS中4℃で一晩破壊し、G.十二指腸栄養型を破壊した。ヘマトキシリンおよびエオシン (H&E) 染色のために新鮮な十二指腸 (長さ 1 cm) を分離しました。
マウスを 2 つのグループに分けました:(i) MOCK 対照グループと (ii) MCC950 阻害剤グループ。各グループには 5 つの治​​療が行われました (n = 7/治療グループ): (i) PBS 治療陰性対照グループ (PBS のみ; 100 μl/マウス PBS、筋肉内 (IM) 注射 (前脛骨筋) [28、29];( ii) pcDNA3.1(+) プラスミド陰性対照群 (100 μg/マウス DNA、筋肉内注射による); (iii) G.十二指腸嚢胞感染陽性対照群 (1.5 x 106 嚢胞/マウス、強制経口投与) (iv) aプラスミド pcDNA3.1(+)-alpha-2 (100 μg/マウス DNA、筋肉注射) で処理したグループ、および (v) プラスミド pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (100 μg/マウス) で処理したグループDNA、12 時間継代後、MCC950 阻害剤グループのマウスには毎日 MCC950 (10 mg/kg 体重) を 7 日間腹腔内注射しましたが、MOCK グループのマウスには等量の PBS 処理を行いました。血液サンプルはマウスの眼球から採取し、4 °C で一晩放置した後、酵素免疫測定法 (ELISA) を使用して血清サンプルを分離し、IL-1β レベルを測定しました。
35匹のマウスを5つのグループに分けた(n=7/グループ)。グループ１は、ＰＢＳで処置した陰性対照グループであった。マウスには、１００μｌのＰＢＳを筋肉内に投与し、３日後に強制経口投与した。グループ2は、G.十二指腸リス嚢胞に感染した陽性対照群です。マウスに100μlのPBSを注射し、3日後に1.5×106個の嚢胞/マウスを胃内注射しました。3番目のグループ – 十二指腸嚢胞感染症の対照群と組み合わせたpcDNA3.1(+)によるプラスミド免疫化: マウスに100μgのプラスミドDNA pcDNA3.1(+)(im)を経口投与、数回にわたって1.5×106個の嚢胞/マウス3を与えた。日々。グループ 4 および 5 は、G. 十二指腸嚢胞感染と組み合わせた組換え pcDNA3.1(+)-α-2 ジャルジン プラスミドまたは pcDNA3.1(+)-α-7.3 ジャルジン プラスミドでした。実験グループ: マウスには 100 μg の pcDNA3 を投与しました。1(+)-giardine プラスミド DNA (im)、3 日後、マウスあたり 1.5 × 106 個の嚢胞を強制経口投与しました。チューブを通して十二指腸 G. 嚢胞を導入した後、各マウスの体重を監視しました。寄生負荷測定および HE 染色分析のために、新鮮な十二指腸を収集しました。
組織病理学的変化は、以前に公開された手順に従って分析されました[30]。新鮮な十二指腸を組織細胞固定剤で固定し、パラフィンに包埋し、4 μm の切片に切断し、H&E で染色し、光学顕微鏡で分析しました。7 匹の独立したマウスから採取した 7 つの組織切片における代表的な病理学的変化は、治療法を知らない病理学者によって評価され、200 倍の倍率で撮影されました。絨毛の長さと陰窩の深さは、前述の方法に従って測定されました。
インビトロおよびインビボの結果は３回得られた。グラフは、GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc.、米国カリフォルニア州ラホーヤ) を使用して生成されました。2 つのグループ間の差異は t 検定によって分析され、3 つ以上のグループ間の差異は SPSS ソフトウェア (バージョン 22.0; SPSS IBM Corp.、アーモンク、ニューヨーク州、米国) を使用して一元配置分散分析 (ANOVA) によって分析されました。データは、Levene の検定に続いて Bonferroni の事後検定を使用して分散の均一性について分析されました (B)。有意性は、P<0.05、P<0.01、および P<0.001 (有意ではない [ns]) (P>0.05) として表されます。
京都遺伝子ゲノム百科事典 (KEGG) における GEV プロテオミクスの以前の分析では、多くの標的が炎症性シグナル伝達経路の活性化に関与している可能性があることが示されました [13]。我々は、2 つの有望なターゲットである alpha-2 および alpha-7.3 giardin を選択し、これらの分子を増幅し、pcDNA3.1(+) 真核生物発現ベクターの構築に使用しました。配列決定後、組換えpcDNA3.1(+)-alpha-2およびalpha-7.3 giardine発現プラスミドを初代マウス腹膜マクロファージにトランスフェクトし、炎症のカスパーゼ-1 p20サインタンパク質（活性化カスパーゼ-1の断片）を同定しました。炎症を引き起こす可能性のある重要な分子を解明します。結果は、α-2 およびα-7.3 ジャルジンが GEV と同様に p20 カスパーゼ-1 発現を誘導できることを示しました。未処理のネガティブコントロール (PBS のみ) およびプラスミドコントロール pcDNA3.1(+) では、カスパーゼ 1 の活性化に対する影響は見つかりませんでした (図 1)。
pcDNA3.1(+)-alpha-2 および alpha-7.3 ジャルジンによる p20 カスパーゼ-1 活性化の測定。組換え真核生物発現プラスミド pcDNA3.1(+)-alpha-2 および alpha-7.3 giardine (各レーンの上) を初代マウス腹膜マクロファージにトランスフェクトし、24 時間後に培養上清を回収しました。ウェスタンブロッティングを使用して、特徴的なカスパーゼ-1 p20 インフラマソームタンパク質の発現レベルを測定しました。PBS のみの治療グループ (レーン C) および pcDNA3.1(+) 単独治療グループ (pcDNA3.1 レーン) をネガティブコントロールとして使用し、GEV 治療グループをポジティブコントロールとして使用しました。組換えタンパク質の発現は、各タンパク質のヒスチジンタグを検出することによって確認され、予想されるタンパク質バンドは、α-2 ジアルジン (38.2 kDa) およびα-7.3 ジアルジン (37.2 kDa) でした。GEV、十二指腸ジアルジア細胞外小胞、pcDNA3.1(+)、EcoRV直線化ベクター、SUP、上清
アルファ-2 ジアルジンおよびアルファ-7.3 ジアルジンが p20 カスパーゼ-1 発現を誘導し、宿主 NLRP3 炎症反応の活性化に役割を果たすかどうかを調べるには、pcDNA3.1(+)-アルファ-2 ジャルジンおよび pcDNA3.1(+)-アルファ-7.3 ジャルジンを組換えプラスミド DNA を用いて初代マウス腹膜マクロファージにトランスフェクトし、主要な炎症タンパク質 NLRP3 の発現、局在、およびオリゴマー化のレベルを測定しました。この実験では、GEV を陽性対照群として使用し、無処理群 (PBS のみ) または pcDNA3.1(+) トランスフェクション処理群を陰性群として使用しました。結果は、GEV グループと同様に、giardin pcDNA3.1(+)-alpha-2 および giardin pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 の組換えプラスミド DNA が NLRP3、pro-IL-1β、およびプロカスパーゼ-1およびカスパーゼ-1の活性化（図2a）。さらに、両方のジャルジンは有意な IL-1β 分泌を誘導しました (pcDNA3.1: ANOVA、F(4, 10) = 1.625、P = 0.1000; α-2 ジャルジン: ANOVA、F(4, 10) = 1.625、P = 0.0007 ）。;α-7.3 ジャルジン: ANOVA、F(4, 10) = 1.625、P<0.0001;GEV: ANOVA、F(4, 10) = 1.625、P = 0.0047) (図 2b)。pcDNA3.1(+)-alpha-2 や pcDNA3.1(+)-alpha- とは対照的に、pcDNA3.1(+) プラスミドをトランスフェクトした無治療群または治療群では、ほとんどの ASC タンパク質が単量体でした。 7.3 ジャルディン。ASC オリゴマー化は、GEV 陽性対照グループまたはグループの組換えプラスミド DNA で発生し、オリゴマー形態を示しました (図 2c)。これらの予備データは、α-2 ジアルジンおよびα-7,3 ジアルジンが NLRP3 炎症活性化を誘導できることを示唆しています。その後の ASC および NLRP3 の局在に関する免疫蛍光研究では、ネガティブ コントロール グループでは、ASC タンパク質が細胞質全体に散在し、ジャルジンまたは pcDNA3 による pcDNA3.1(+)-alpha-2 の刺激によりドット シグナルとして現れることが示されました。1(+)-α-7,3 ジアルジン グループまたは GEV ポジティブ コントロール グループ (図 2d)。ネガティブ コントロールおよびプラスミド処理した pcDNA 3.1 グループでは、NLRP3 タンパク質シグナルは検出されませんでしたが、pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine または pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 に応答して蛍光シグナル ドットが検出されました。が検出されました。。ジャルジンは細胞質内またはHEVの刺激時に見られます（図2e）。これらのデータはさらに、G. デュオデナリス ジャルジン アルファ-2 およびジャルジン アルファ-7.3 がマウス初代腹膜マクロファージの NLRP3 インフラマソームを活性化することを示しています。
pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin および pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin は、マウス腹膜マクロファージの NLRP3 インフラマソームを活性化します。組換え真核生物発現プラスミド pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin および pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin を初代マウス腹膜マクロファージおよび細胞にトランスフェクトするか、発現やオリゴマー化の分析のために 24 時間以内に上清を回収します。 、分泌。重要な炎症性タンパク質の局在化。PBS のみ (C) グループと pcDNA3.1(+) 単独治療グループをネガティブ コントロールとして使用し、GEV 治療グループをポジティブ グループとして使用しました。a NLRP3、プロ IL-1β、プロカスパーゼ-1、および p20 カスパーゼ-1 を含む主要な炎症タンパク質 NLRP3 が、ウェスタン ブロッティングによって検出されました。b 上清中のIL-1βの分泌レベルは、酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）を使用して測定されました。対照群と実験群間の差異は、SPSS ソフトウェア バージョン 22.0 を使用して一元配置分散分析 (ANOVA) によって分析されました。アスタリスクは、グループ **P<0.01 と ***P<0.001 間の有意差を示します。c ペレット中のASCオリゴマー化レベルはDSS架橋分析によって決定され、細胞溶解物中のASCレベルはローディングコントロールとして使用されました。d 免疫蛍光を使用した ISC 局在の視覚化。e 免疫蛍光を使用して、NLRP3 の局在を視覚化しました。ASC、アポトーシス斑点様タンパク質。IL、インターロイキン。NLRP3、ヌクレオチド結合オリゴマー化様受容体 3。ns、有意ではない (P > 0.05)
G. デュオデナリスとそれが分泌する GEV は両方とも、NLRP3 インフラマソームを活性化し、in vitro で宿主の炎症反応を調節します。したがって、G.十二指腸の病原性におけるNLRP3インフラマソームの役割は依然として不明である。この問題を調査するために、十二指腸 G. 嚢胞に感染したマウスと十二指腸 G. 嚢胞 + MCC950 阻害剤治療に感染したマウスの間で実験を計画し、十二指腸 G. 嚢胞に感染したときの NLRP3 インフラマソーム発現を比較しました。実験の詳細なスキームを図3aに示します。異なる治療群のマウスの体重変化を嚢胞感染後7日間モニタリングし、結果を図3bに示します。純粋なPBSで処理したグループと比較して、結果は、(i) G.十二指腸嚢胞に感染したマウスの体重は、感染後3日目から7日目まで減少したことを示した。(ii) MCC950 阻害剤による治療はマウスの体重に有意な影響を与えませんでした。。単一感染グループと比較して、MCC950 で治療した十二指腸感染グループの BW はさまざまな程度に減少しました (1 日目: ANOVA、F(3, 24) = 1.885、P = 0.0148; 2 日目: ANOVA、F( 3, 24) ) = 0.4602、P<0.0001; 3 日目: ANOVA、F(3, 24) = 0.8360、P = 0.0010; 4 日目: ANOVA、F(3, 24) = 1.683、P = 0.0052; (3, 24)=0.6497、P=0.0645; 6 日目: ANOVA、F(3, 24)=5.457、P=0.0175; 7 日目: ANOVA、F(3, 24) = 2.893、P = 0.0202)。これらのデータは、NLRP3 インフラマソームが十二指腸感染の初期段階 (2 ～ 4 日) でマウスを大幅な体重減少から保護することを示しています。次に、十二指腸洗浄液中の G. デュオデナリス トロフォゾイトの検出を目的としました。結果を図 3c に示します。G. 十二指腸嚢胞感染グループと比較して、十二指腸内の栄養型の数は、NLRP3 インフラマソームの遮断後に有意に増加しました (t(12) = 2.902、P = 0.0133)。HE で染色した十二指腸組織は、PBS および MCC950 単独で処理した陰性対照と比較して、次のことを示しました。 (i) G. 十二指腸嚢胞感染により十二指腸絨毛が損傷した (ANOVA、F(3, 24)=0.4903、P= 0.0488) ) および陰窩萎縮 (ANOVA、F(3, 24) = 0.4716、P = 0.0089);(ii) G. デュオデナリス嚢胞に感染し、MCC950 阻害剤で治療されたマウスの十二指腸。十二指腸絨毛は損傷して死滅しており（ANOVA、F（3、24）= 0.4903、P = 0.0144）、萎縮と陰窩分岐を伴っていました（ANOVA、F（3、24）= 0.4716、P = 0、0481）（図3d-） f) 。これらの結果は、NLRP3 インフラマソームが十二指腸 G. の病原性を軽減する役割を果たしていることを示唆しています。
十二指腸ジアルジア感染症におけるNLRP3インフラマソームの役割。マウスに十二指腸球菌嚢胞を強制経口投与(iv)し、その後MCC950の有無にかかわらず(腹腔内)処置した。PBSまたはMCC950による単一治療群を対照として使用した。実験グループと治療計画。b さまざまな治療グループのそれぞれのマウスの体重を 7 日間モニタリングしました。Ｇ．デュオデナリス感染群とＧ．デュオデナリス＋ＭＣＣ９５０感染治療群との間の差異を、ＳＰＳＳソフトウェアバージョン２２．０を使用するｔ検定によって分析した。アスタリスクは、*P<0.05、**P<0.01、または ***P<0.001 での有意差を示します。c 寄生負荷は、十二指腸洗浄液中の栄養型の数を計数することによって決定されました。Ｇ．デュオデナリス感染群とＧ．デュオデナリス＋ＭＣＣ９５０感染治療群との間の差異を、ＳＰＳＳソフトウェアバージョン２２．０を使用するｔ検定によって分析した。アスタリスクは、*P < 0.05 での有意差を示します。d 十二指腸の組織病理学のヘマトキシリンおよびエオシン (H&E) 染色の結果。赤い矢印は絨毛への損傷を示し、緑色の矢印は陰窩への損傷を示します。スケールバー: 100 μm。e、f 十二指腸絨毛の高さとマウス陰窩の高さの統計分析。アスタリスクは、*P<0.05 および **P<0.01 での有意差を示します。結果は 7 つの独立した生物学的実験から得られました。BW、体重。例、胃内送達ルート。ip、腹腔内送達ルート。ns、有意ではない（P > 0.05）。PBS、リン酸緩衝生理食塩水。WT、野生型
IL-1β の分泌は炎症活性化の特徴です。G. デュオデナリス アルファ-2 ジャルジンおよびアルファ-7.3 ジャルジンが in vivo で NLRP3 宿主インフラマソームを活性化するかどうかを調べるために、未処理の WT マウス (偽グループ) と NLRP3 インフラマソームをブロックしたマウス (MCC950 阻害処理グループ) を使用しました。実験の詳細なスキームを図4aに示します。実験群は、PBS、胃管栄養法によるG.十二指腸嚢胞治療、pcDNA3.1の筋肉内注射、およびpcDNA3.1(+)-α-2ジャルジンまたはpcDNA3.1-α-7.3ジャルジンの筋肉内注射で処置されたマウスから構成された。組換えプラスミドの筋肉内投与後７日目に血清を採取し、各群のＩＬ－１βレベルを測定した。図4bに示すように、MOCKグループでは：（i）PBSグループと比較して、pcDNA3.1処理はIL-1β分泌に有意な影響を与えませんでした（ANOVA、F（4.29）= 4.062、P = 0.9998）。 IL-β 分泌は、G.十二指腸嚢胞群で有意に上昇しました (ANOVA、F(4, 29) = 4.062、P = 0.0002)、(ii) pcDNA3.1-alpha-2 giardine および pcDNA3。1- α-7.3 ジアルジンの筋肉内注射により、血清 IL-1β レベルが有意に増加しました (ANOVA、F(4, 29) = 4.062、P<0.0001)。(iii) pcDNA3.1-α-7,3 ジアルジンは、pcDNA3.1-α-2 ジアルジン筋肉内注射群において高レベルの IL -1β 分泌を誘導しました (ANOVA、F(4, 29) = 4.062、P = 0.0333) 。MCC950治療群とMOCK群の各群との比較： (i) PBS対照群とpcDNA3.1対照群では、MCC950阻害剤の遮断後にIL-1β分泌量がある程度低下したが、差は生じなかった。有意 (PBS: ANOVA、F (9, 58) = 3.540、P = 0.4912 pcDNA3.1: ANOVA、F(9, 58) = 3.540、P = 0.5949)。(ii) MCC950 をブロックした後。、IL-1β 分泌は、G. デュオデナリス嚢胞感染グループ、pcDNA3.1-alpha-2 ジャルジン グループ、pcDNA3.1-alpha-7.3 ジャルジン グループで有意に減少しました (G. デュオデナリス: ANOVA, F(9 、58) = 3.540、P = 0.0120、pcDNA3.1-α-2 ジアルジン: ANOVA、F(9, 58) = 3.540、P = 0.0447; pcDNA3.1-α-7.3 ジアルジン: ANOVA、F(9, 58) ) = 3.540、P = 0.0164)。これらの結果は、α-2 ジアルジンおよびα-7.3 ジアルジンが in vivo での NLRP3 インフラマソームの活性化を媒介することを示唆しています。
pcDNA3.1(+)-giardine は、生体内で NLRP3 宿主インフラマソームを活性化します。マウスを組換え真核生物発現プラスミドpcDNA3.1(+)-alpha-2 giardineまたはpcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardineで免疫(IM)し、その後MCC950で処理した(腹腔内; MCC950グループ)か否か(ダミーグループ) ）。PBSまたはpcDNA3.1(+)プラスミド処理グループをネガティブコントロールとして使用し、G.十二指腸嚢胞処理グループをポジティブコントロールとして使用しました。実験グループと治療計画。b マウスの血清IL-1βレベルを7日目にELISAアッセイにより測定した。MOCK グループのグループ間の差異は一元配置分散分析を使用して分析し、MOCK グループと MCC950 グループ間の差異は SPSS ソフトウェア バージョン 22.0 の t 検定を使用して分析しました。アスタリスクは、MOCK グループにおける治療グループ間の有意差を示します (*P<0.05 および ***P<0.001)。ドル記号 ($) は、MOCK グループと MCC950 グループの各グループ間の P<0.05 の有意差を示します。7 つの独立した生物学的実験の結果。i、筋肉内注射、ns、有意ではない（P > 0.05）
NLRP3 宿主インフラマソームのα-2 およびα-7.3 ジアルジンを介した活性化が G. 十二指腸リスの感染力に及ぼす影響を調べるために、WT C57BL/6 マウスを使用し、α-2 ジアルジンおよびα-7.3 ジアルジンを注射しました。3日後にプラスミドをG.十二指腸嚢胞の胃管を通して筋肉内注射し、その後マウスを7日間観察した。実験の詳細なスキームを図5aに示します。毎日、マウスの体重を測定し、投与後７日目に胃管より新鮮な十二指腸組織を採取し、栄養型の数を測定し、病理組織学的変化を観察した。図5bに示すように、給餌時間が増加するにつれて、各グループのマウスのBWは徐々に増加しました。マウスのMTは、G.十二指腸嚢胞の胃内投与後3日目に減少し始め、その後徐々に増加した。α-2 ジアルジンおよびα7.3 ジアルジンの筋肉内注射によって誘導された NLRP3 インフラマソームの活性化は、マウスの体重減少を有意に軽減しました (1 日目: pcDNA3.1-α-2 ジアルジン、ANOVA、F(4, 30) = 1.399、P = 0 .9754 1 日目: pcDNA3.1-alpha-7.3 ジャルジン、ANOVA、F(4, 30)=1.399、P=0.9987 2 日目: pcDNA3.1-alpha-2 ジャルジン、ANOVA、F( 4, 30) = 0.3172、P = 0.9979; 2 日目: pcDNA3.1-alpha-7.3 ジャルジン、ANOVA、F(4, 30) = 0.3172、P = 0.8409; 3 日目: pcDNA3.1-alpha-2 ジャルジン、ANOVA、F( 4, 30) = 0.8222、P = 0.0262 3 日目: pcDNA3.1-alpha-7.3 ジャルジン、ANOVA、F(4, 30) = 0.8222、P = 0.0083; 4 日目: pcDNA3.1-alpha-2 ジャルジン、ANOVA 、F(4, 30) = 0.5620、P = 0.0012、4 日目: pcDNA3.1-alpha-7.3 ジャルジン、ANOVA、F(4, 30) = 0.5620、P < 0.0001、5 日目: pcDNA3.1-alpha - 2 ジャルジン、ANOVA、F(4, 30) = 0.9728、P < 0.0001 5 日目: pcDNA3.1-alpha -7.3 ジャルジン、ANOVA、F(4, 30) = 0.9728、P < 0.0001 6 日目: pcDNA3 .1 -アルファ-2 ジャルジン、ANOVA、F(4, 30) = 0.7154、P = 0.0012、6 日目:pcDNA3.1-アルファ-7.3 ジャルジン、ANOVA、F(4, 30) = 0.7154、P = 0.0006。7 日目: pcDNA3.1-alpha-2 ジャルジン、ANOVA、F(4, 30) = 0.5369、P<0.0001 7 日目: pcDNA3.1-alpha-7.3 ジャルジン、ANOVA、F(4, 30) = 0.5369、P <0.0001)。寄生負荷は十二指腸で評価されました (図 5c)。未処理の陽性対照および空の pcDNA3.1 ベクターを注射したグループと比較して、G. デュオデナリス トロフォゾイトの数は、α-2 ジャルジンおよび α-7,3 ジャルジン (pcDNA3.1-alpha) を注射したグループで有意に減少しました。 -2 ジャルジン: ANOVA、F(3, 24) = 1.209、P = 0.0002、pcDNA3.1-alpha-7.3 ジャルジン: ANOVA、F(3, 24) = 1.209、P<0.0001)。さらに、ジャルジン アルファ-7.3 は、ジャルジン アルファ-2 よりもマウスの防御力が高かった (ANOVA、F(3, 24) = 1.209、P = 0.0081)。HE染色の結果を図に示します。5d–f。アルファ-2 ジアルジンおよびアルファ-7.3 ジアルジンを注射したマウスは、G. 十二指腸リスを注射したマウスや、G. 十二指腸リスと空の pcDNA3 ベクター.1 Zoom を組み合わせて注射したマウスと比較して、絨毛損傷によって明らかとなる十二指腸組織の病変が少なかった。(pcDNA3.1-alpha-2 ジャルジン: ANOVA、F(3, 24) = 2.466、P = 0.0035 または P = 0.0068、pcDNA3.1-alpha-7.3 ジャルジン: ANOVA、F(3, 24) = 2.466、P = 0.0028 または P = 0.0055）および陰窩萎縮の減少（pcDNA3.1-alpha-2 ジャルジン: ANOVA、F(3, 24) = 1.470、P = 0.0264 または P = 0.0158、pcDNA3.1-alpha-7.3 ジャルジン: ANOVA 、F(3, 24) = 1.470、P = 0.0371 または P = 0.0191)。これらの結果は、α-2 ジアルジンおよびα-7,3 ジアルジンが、生体内で NLRP3 インフラマソームを活性化することによって G. 十二指腸リスの感染力を低下させることを示唆しています。
G.十二指腸感染症におけるpcDNA3.1(+)-ジャルジンの役割。マウスを組換え真核生物発現プラスミドpcDNA3.1(+)-alpha-2 giardineまたはpcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardineで免疫し(IM)、その後G.十二指腸嚢胞で攻撃した(ig)。PBS群およびpcDNA3.1(+)+十二指腸嚢胞治療群を陰性対照群として使用し、十二指腸嚢胞治療群を陽性対照群として使用した。実験グループと治療計画。b 様々な治療群のそれぞれにおけるマウスのMTを、攻撃後7日間モニタリングした。アスタリスクは、G.十二指腸群とpcDNA3.1(+)-α-2ジャルジン群の群間の有意差を示します(*P<0.05、**P<0.01、および***P<0.001)。ドル記号 ($) は、G. duedenalis の各グループと pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 jardine グループ間の有意差 ($$P<0.01 および $$$P<0.001) を示します。c 寄生虫負荷は、十二指腸 (長さ 3 cm) からの十二指腸洗浄液 1 ml 中の栄養型の数を計数することによって決定され、十二指腸 1 cm あたりの寄生虫の数として表されました。G. デュオデナリス感染グループ、pcDNA3.1(+)-alpha-2 ジャルジン グループ、および pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 ジャルジン グループ間の差異を、SPSS ソフトウェア バージョン 22.0 を使用した一元配置分散分析によって分析しました。アスタリスクは、**P<0.01 および ***P<0.001 での有意差を示します。d 十二指腸の組織病理学的変化。赤い矢印は絨毛への損傷を示し、緑色の矢印は陰窩への損傷を示します。スケールバー: 100 μm。e、f マウス十二指腸絨毛高さ (e) および陰窩高さ (f) の統計分析。図 1d のグループ間の差異は、SPSS ソフトウェア バージョン 22.0 を使用して一元配置分散分析によって分析されました。アスタリスクは、*P<0.05 および **P<0.01 での有意差を示します。7 つの独立した生物学的実験の結果。ns、有意ではない (P > 0.05)
十二指腸ジアルジアは、ジアルジア症を引き起こす、ヒトおよび他の哺乳動物の腸内寄生虫としてよく知られています。2004 年には、特に社会経済的地位が低い地域社会での 6 年間にわたる高い有病率のため、WHO の顧みられない病気イニシアチブに加えられました [32]。自然免疫系は、G. デュオデナリス感染に対する免疫応答において重要な役割を果たします。マウスのマクロファージは、細胞外トラップを放出することによって十二指腸ブドウ球菌を飲み込んで殺すことが報告されている[33]。我々のこれまでの研究では、非侵襲性の細胞外寄生虫であるG.十二指腸リスが、マウスマクロファージのp38 MAPK、ERK、NF-κB p65、およびNLRP3炎症シグナル伝達経路を活性化して宿主の炎症反応を調節し、放出されたGEVがこのプロセスを強化する可能性があることを示している。13]、24]。しかし、GEV における NLRP3 インフラマソーム制御炎症に関与する正確な PAMP と、ジアルジア症における NLRP3 インフラマソームの役割はまだ解明されていません。これら 2 つの疑問を明らかにするために、私たちはこの調査を実施しました。
NLRP3 インフラマソームは免疫細胞の細胞質に位置し、尿酸結晶、毒素、細菌、ウイルス、寄生虫などのさまざまな粒子によって活性化されます。細菌の研究では、毒素は炎症センサーを活性化し、炎症や細胞死を引き起こす重要な PAMP であることが特定されています [34]。黄色ブドウ球菌 [35] や大腸菌 [36] の溶血素、エンテロトキシン (NHE) の溶血素 BL (HBL) [37] など、構造的に多様な毒素の一部は、NLRP3 炎症の活性化を誘導します。ウイルス研究では、SARS-COV-2 エンベロープ (E) タンパク質 [38] やジカウイルス NS5 タンパク質 [39] などの病原性タンパク質が、NLRP3 受容体によって認識される重要な PAMP であることが示されています。寄生虫の研究では、トキソプラズマ・ゴンディ、膣トリコモナス[40]、クルーズトリパノソーマ[41]、リーシュマニア[42]など、多くの寄生虫が宿主のインフラマソーム活性化に関連していることが報告されています。高密度顆粒タンパク質 GRA35、GRA42、および GRA43 は、トキソプラズマ ゴンディの毒性に関連しており、ルイス ラット マクロファージにおけるピロトーシスの誘導に必要です [43]。さらに、いくつかのリーシュマニア研究では、寄生虫膜リポホスホグリカン [44] や亜鉛メタロプロテアーゼ [45] など、NLRP3 インフラマソームに関与する個々の分子に焦点を当てています。アネキシン様アルファ-ジャルジンファミリーの遺伝子のうち、アルファ-1 ジャルジンは、マウスモデルにおいて十二指腸G.に対する防御を提供する潜在的なワクチン候補であることが示されている[18]。私たちの研究では、ジアルジアに特有であるが比較的報告が少ないG.十二指腸の病原性因子α-2およびα-7,3ジアルジンを選択しました。これら 2 つの標的遺伝子は、炎症活性化の分析のために pcDNA3.1(+) 真核生物発現システム ベクターにクローン化されました。
私たちのマウスモデルでは、切断されたカスパーゼ断片が炎症活性化のマーカーとして機能します。刺激を受けると、NLRP3 は ASC と相互作用し、プロカスパーゼを動員し、プロ IL-1β とプロ IL-18 をそれぞれ成熟 IL-1β と IL-18 に切断する活性カスパーゼを生成します。炎症性カスパーゼ (カスパーゼ-1、-4、-5、および -11) は、先天性防御に重要なシステイン プロテアーゼの保存されたファミリーであり、炎症およびプログラム細胞死に関与しています [46]。カスパーゼ-1は標準的なインフラマソームによって活性化されます[47]が、カスパーゼ-4、-5、および-11は非定型的なインフラマソームの形成中に切断されます[48]。この研究では、マウス腹膜マクロファージをモデルとして使用し、G.十二指腸感染症の研究における宿主NLRP3炎症活性化のマーカーとしてp20カスパーゼ-1切断カスパーゼ-1を調査しました。その結果、多くのα-ジャルジンが炎症の典型的な活性化に関与していることが示され、これは細菌やウイルスに関与する重要な病原性分子の発見と一致しています。しかし、我々の研究は予備的なスクリーニングにすぎず、我々の以前の研究でG.十二指腸感染症において古典的インフラマソームと非古典的インフラマソームの両方が見つかったように、非古典的インフラマソームを活性化できる他の分子が存在する[13]。生成された p20 カスパーゼ-1 が NLRP3 インフラマソームと関連しているかどうかをさらに決定するために、α-2 および α-7.3 ジャルジンをマウス腹膜マクロファージにトランスフェクトし、重要な分子タンパク質の発現レベルと ASC オリゴマー化レベルを測定し、両方の α-ジャルジンが活性化されることを確認しました。インフラマソーム NLRP3。我々の結果は、G. muris または E. coli EPEC 株単独で Caco-2 細胞を刺激すると、NLRP3、ASC、およびカスパーゼ-1 の蛍光強度が増加する可能性があると報告した Manko-Prykhoda らの結果とはわずかに異なります。有意ではないが、G. muris と E. coli の同時刺激が 3 つのタンパク質のレベルをどのように増加させるかについても研究した [49]。この不一致は、ジアルジア属の種、細胞株、初代細胞の選択の違いによるものと考えられます。また、十二指腸感染症に感染しやすい生後 5 週齢の雌 WT C57BL/6 マウスで MCC950 を使用した in vivo アッセイも実施しました。MCC950 は、ナノモル濃度で標準および非標準 NLRP3 活性化をブロックする、強力かつ選択的な小分子 NLRP3 阻害剤です。MCC950はNLRP3の活性化を阻害しますが、AIM2、NLRC4、NLRP1の炎症経路やTLRシグナル伝達経路の活性化には影響を与えません[27]。MCC950 は NLRP3 活性化をブロックしますが、NLRP3 の開始、K+ 流出、Ca2+ 流入、または NLRP3 と ASC 間の相互作用は阻害しません。代わりに、ASC のオリゴマー化をブロックすることで NLRP3 インフラマソームの活性化を阻害します [27]。したがって、我々は、ジアルジン注射後の NLRP3 インフラマソームの役割を決定するための in vivo 研究で MCC950 を使用しました。活性化されたカスパーゼ-1 p10は、炎症誘発性サイトカインであるプロIL-1βおよびプロIL-18を成熟IL-1βおよびIL-18に切断します[50]。この研究では、MCC950の有無にかかわらず、ジャルジン処置マウスの血清IL-1βレベルを、NLRP3インフラマソームが活性化されているかどうかの指標として使用しました。予想通り、MCC950 治療により血清 IL-1β レベルが大幅に減少しました。これらのデータは、G. デュオデナリス ジャルディン アルファ-2 およびジャルジン アルファ-7.3 が NLRP3 マウス インフラマソームを活性化できることを明確に示しています。
過去 10 年間に蓄積された重要なデータにより、IL-17A が G. muris に対する免疫のマスター調節因子であり、IL-17RA シグナル伝達の誘導、抗菌ペプチドの産生、補体活性化の調節を行っていることが実証されています [51]。しかし、ジアルジア感染は若年成人でより頻繁に発生し、若いマウスのジアルジア感染はIL-17A応答を活性化して保護効果を発揮しないことが報告されており[52]、研究者は他の免疫調節性ジアルジアを探すよう促されている。蠕虫感染のメカニズム。最近の研究の著者らは、G. muris が大腸菌 EPEC によって NLRP3 インフラマソームを活性化し、抗菌ペプチドの産生を促進し、その付着能力と腸管内の栄養型の数を減少させ、それによって結腸の重症度を軽減することができると報告しました。桿菌によって引き起こされる病気 [49]。NLRP3 インフラマソームは、さまざまな病気の発症に関与しています。研究では、緑膿菌が細胞死を回避するためにマクロファージのオートファジーを誘発し、このプロセスがNLRP3インフラマソームの活性化に依存していることが示されている[53]。N. カニナムの場合、活性酸素種を介した NLRP3 インフラマソームの活性化により宿主内での複製が制限され、潜在的な治療標的となっています [9]。Paracoccidioides brasiliensis は、マウス骨髄由来樹状細胞において NLRP3 インフラマソームの活性化を誘導し、その結果、宿主防御に重要な役割を果たす炎症性サイトカイン IL-1β の放出を引き起こすことが判明しています [10]。L.アマゾネンシス、L.メジャー、L.ブラジリエンシス、L.インファンタム・チャガシを含むいくつかのリーシュマニア種は、リーシュマニア感染と同様に、マクロファージのNLRP3およびASC依存性カスパーゼ-1を活性化します。NLRP3/ASC/カスパーゼ-1 遺伝子が欠損したマウスでは、寄生虫の複製が増強されます [11]。ザンボーニら。リーシュマニア感染は、マクロファージの NLRP3 インフラマソームの活性化を誘導し、細胞内寄生虫の複製を制限することが報告されています。したがって、リーシュマニアは回避戦略として NLRP3 活性化を阻害する可能性があります。in vivo 研究では、NLRP3 インフラマソームはリーシュマニア症の排除に寄与しましたが、組織には影響を与えませんでした [54]。逆に、蠕虫症の研究では、NLRP3 インフラマソームの活性化により、胃腸蠕虫症に対する宿主の防御免疫が抑制されました [12]。赤癬菌は、世界中で下痢を引き起こす主な細菌の 1 つです。これらの細菌は、P2X7 受容体を介した K+ 流出、活性酸素種、リソソームの酸性化、およびミトコンドリア損傷を通じて IL-1β 産生を誘導する可能性があります。NLRP3 インフラマソームは、シゲラに対するマクロファージの食作用と殺菌活性を負に制御します [55]。マラリア原虫の研究では、マラリア原虫に感染したAIM2、NLRP3、またはカスパーゼ-1欠損マウスは高レベルの1型インターフェロンを産生し、マラリア原虫感染に対する耐性がより高いことが示されている[56]。しかし、マウスにおけるNLRP3炎症の病原性活性化におけるα-2ジャルジンおよびα-7.3ジャルジンの役割は不明である。
この研究では、MCC950によるNLRP3インフラマソームの阻害により、マウスの腸洗浄液中のBWが減少し、栄養型の数が増加し、その結果、十二指腸組織においてより重度の病理学的変化が引き起こされた。アルファ-2 ジャルジンおよびアルファ-7.3 ジャルジンは、宿主マウス NLRP3 インフラマソームを活性化し、マウスの体重を増加させ、腸洗浄液中の栄養型の数を減らし、病的十二指腸病変を緩和します。これらの結果は、G. デュオデナリスがα-2 ジャルジンおよびα-7,3 ジャルジンを介して NLRP3 宿主インフラマソームを活性化し、マウスにおける G. デュオデナリスの病原性を軽減できることを示唆しています。
まとめると、我々の結果は、α-2 およびα-7.3 ジャルジンが NLRP3 宿主インフラマソームの活性化を誘導し、マウスにおける G. 十二指腸リスの感染力を低下させることを示しています。したがって、これらの分子はジアルジア症の予防の有望な標的となります。
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
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