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肺嚢胞性線維症の治療のための遺伝子ベクターは、末梢肺の伝達には治療効果がないため、伝導気道を標的とする必要があります。ウイルス導入の効率は、キャリアの滞留時間に直接関係します。しかし、遺伝子担体などの送達流体は吸入中に自然に肺胞内に拡散し、あらゆる形状の治療用粒子は粘液線毛輸送によって迅速に除去されます。気道における遺伝子キャリアの滞留時間を延長することは重要ですが、達成するのは困難です。気道の表面に向けることができるキャリア共役磁性粒子は、局所的な標的化を改善することができます。in vivo イメージングの問題により、印加された磁場の存在下での気道表面上のこのような小さな磁性粒子の挙動はほとんど理解されていません。この研究の目的は、生体内での単一粒子およ​​びバルク粒子の挙動のダイナミクスとパターンを研究するために、シンクロトロンイメージングを使用して、麻酔をかけたラットの気管内の一連の磁性粒子の動きを生体内で視覚化することでした。次に、磁場の存在下でのレンチウイルス磁性粒子の送達がラットの気管における形質導入の効率を高めるかどうかも評価しました。シンクロトロン X 線イメージングは​​、in vitro および in vivo の静止磁場および移動磁場における磁性粒子の挙動を示します。磁石を使って粒子を生体気道の表面を横切って簡単に引きずることはできませんが、輸送中、磁場が最も強い視野に堆積物が集中します。磁場の存在下でレンチウイルス磁性粒子を送達すると、形質導入効率も 6 倍増加しました。総合すると、これらの結果は、レンチウイルスの磁性粒子と磁場が、生体内での伝導気道における遺伝子ベクターの標的化と伝達レベルを改善するための貴重なアプローチである可能性があることを示唆しています。
嚢胞性線維症 (CF) は、CF 膜貫通コンダクタンス制御因子 (CFTR) と呼ばれる単一遺伝子の変異によって引き起こされます。CFTR タンパク質は、嚢胞性線維症の発症の主要な部位である気道を含む、体全体の多くの上皮細胞に存在するイオン チャネルです。CFTR の欠陥は、異常な水分輸送、気道表面の脱水、気道表面液体層 (ASL) 深さの減少を引き起こします。また、吸入した粒子や病原体を気道から除去する粘液線毛輸送（MCT）システムの能力も損ないます。私たちの目標は、CFTR 遺伝子の正しいコピーを導入して ASL、MCT、肺の健康を改善するレンチウイルス (LV) 遺伝子治療を開発し、生体内でこれらのパラメーターを測定できる新しい技術の開発を続けることです1。
LV ベクターは、主に治療用遺伝子を気道基底細胞 (気道幹細胞) に永続的に組み込むことができるため、嚢胞性線維症遺伝子治療の有力な候補の 1 つです。これは、嚢胞性線維症に関連する機能的な遺伝子修正された気道表面細胞に分化することで正常な水分補給と粘液クリアランスを回復し、生涯にわたる利益をもたらすことができるため、重要です。肺の CF への関与が始まる場所であるため、LV ベクトルは伝導性気道に向けられる必要があります。ベクターを肺の深部に送達すると肺胞伝達が起こる可能性がありますが、嚢胞性線維症には治療効果がありません。しかし、遺伝子担体などの液体は、出産後に吸入されると自然に肺胞に移動し 3,4 、治療用粒子は MCT によって急速に口腔内に排出されます。LV 形質導入の効率は、細胞への取り込みを可能にするためにベクターが標的細胞の近くに留まる時間の長さに直接関係しています。「滞留時間」5 は、典型的な局所的な気流や粘液と MCT 粒子の調整された取り込みによって容易に短縮されます。嚢胞性線維症の場合、気道内での LV 滞留時間を延長する能力は、この領域で高レベルの伝達を達成するために重要ですが、これまでのところ困難です。
このハードルを克服するために、LV 磁性粒子 (MP) が 2 つの相補的な方法で役立つことを提案します。第一に、それらは磁石によって気道表面に誘導され、標的を改善し、遺伝子担体粒子が気道の適切な領域に存在するのを助けることができる。MP は、細胞膜に付着するか、それぞれの細胞表面受容体に結合して腫瘍部位に蓄積する抗体、化学療法薬、またはその他の小分子に結合する場合、標的薬物送達ビヒクルとして広く使用されています。静電気の存在。がん治療のための磁場 7. 他の「温熱」法は、振動磁場にさらされたときに MP を加熱することによって腫瘍細胞を殺すことを目的としています。磁気トランスフェクションの原理は、磁場をトランスフェクション剤として使用して細胞への DNA の導入を促進するもので、一般に in vitro で、形質導入が困難な細胞株に対してさまざまな非ウイルスおよびウイルス遺伝子ベクターを使用して使用されます。 。。静磁場の存在下でヒト気管支上皮の細胞株にインビトロでLV MPを送達するLV磁気トランスフェクションの効率が確立され、LVベクター単独と比較して形質導入効率が186倍増加した。LV MT は嚢胞性線維症の in vitro モデルにも適用されており、磁気トランスフェクションにより、嚢胞性線維症喀痰の存在下で気液界面培養における LV 形質導入が 20 倍増加しました 10。しかし、in vivo 臓器磁気トランスフェクションは比較的注目されておらず、特に肺における少数の動物研究 11、12、13、14、15 でのみ評価されています 16、17。しかし、嚢胞性線維症の肺治療における磁気トランスフェクションの可能性は明らかです。タンら。(2020) は、「磁性ナノ粒子の効果的な肺送達に関する検証研究は、嚢胞性線維症患者の臨床転帰を改善するための将来の CFTR 吸入戦略への道を開くだろう」と述べています6。
印加された磁場の存在下での気道の表面上の小さな磁性粒子の挙動は、視覚化して研究することが困難であるため、ほとんど理解されていません。他の研究では、ガスチャネルの表面水和を直接測定するために、ASL18の深さとMCT19の挙動の微小な生体内変化を非侵襲的にイメージングおよび定量化するためのシンクロトロン伝播ベースの位相コントラストX線イメージング（PB-PCXI）法を開発しました20。治療効果の早期指標として使用されます。さらに、当社の MCT スコアリング方法では、PB-PCXI21 で表示できる MCT マーカーとして、アルミナまたは高屈折率ガラスで構成される直径 10 ～ 35 μm の粒子が使用されます。どちらの方法も、MP を含むさまざまな種類の粒子のイメージングに適しています。
当社の PB-PCXI ベースの ASL および MCT アッセイは、空間的および時間的分解能が高いため、生体内での単一およびバルク粒子のダイナミクスと挙動パターンを研究するのに適しており、MP 遺伝子送達法の理解と最適化に役立ちます。ここで使用するアプローチは、SPring-8 BL20B2 ビームラインを使用した研究に基づいています。この研究では、マウスの鼻気道と肺気道にダミーベクターを投与した後の体液の動きを視覚化し、観察された不均一な遺伝子発現パターンの説明に役立てました。私たちの遺伝子の中に。キャリア用量 3.4 を用いた動物実験。
この研究の目的は、PB-PCXI シンクロトロンを使用して、生きたラットの気管内の一連の MP の生体内運動を視覚化することでした。これらの PB-PCXI イメージング研究は、MP シリーズ、磁場強度、位置をテストして、MP の動きに対する影響を判断するように設計されています。私たちは、外部磁場が、送達された MF がターゲットエリアに留まるか、ターゲットエリアに移動するのに役立つと仮定しました。これらの研究により、堆積後に気管内に残る粒子の量を最大化する磁石の構成を決定することもできました。2 番目の研究シリーズでは、気道ターゲティングの状況での LV-MP の送達が結果をもたらすという仮定に基づいて、この最適な構成を使用して、ラット気道への LV-MP の in vivo 送達から生じる伝達パターンを実証することを目的としました。 LV伝達効率の増加。。
すべての動物実験は、アデレード大学 (M-2019-060 および M-2020-022) および SPring-8 シンクロトロン動物倫理委員会によって承認されたプロトコルに従って実施されました。実験はARRIVEの推奨に従って実施されました。
すべての X 線画像は、以前に説明したものと同様のセットアップを使用して、日本の SPring-8 シンクロトロンの BL20XU ビームラインで撮影されました。簡単に言うと、実験ボックスはシンクロトロン貯蔵リングから 245 m の場所にありました。粒子イメージング研究ではサンプルから検出器までの距離 0.6 m が使用され、in vivo イメージング研究では位相コントラスト効果を生み出すために 0.3 m が使用されます。エネルギー25keVの単色ビームを使用した。画像は、sCMOS 検出器に接続された高解像度 X 線トランスデューサー (SPring-8 BM3) を使用して取得されました。トランスデューサは、厚さ 10 µm のシンチレータ (Gd3Al2Ga3O12) を使用して X 線を可視光に変換し、X 10 (NA 0.3) の顕微鏡対物レンズを使用して sCMOS センサーに照射します。sCMOS 検出器は、アレイ サイズ 2048 × 2048 ピクセル、生ピクセル サイズ 6.5 × 6.5 μm の Orca-Flash4.0 (浜松ホトニクス、日本) でした。この設定により、有効等方性ピクセル サイズは 0.51 μm、視野は約 1.1 mm × 1.1 mm になります。100 ミリ秒の曝露期間は、呼吸によって引き起こされる動きアーチファクトを最小限に抑えながら、気道の内側と外側の磁性粒子の信号対雑音比を最大にするために選択されました。in vivo 研究では、高速 X 線シャッターが X 線経路に配置され、露光間の X 線ビームを遮断することで放射線量を制限しました。
BL20XU イメージング チャンバーはバイオセーフティ レベル 2 の認定を受けていないため、LV 培地は SPring-8 PB-PCXI イメージング研究では使用されませんでした。代わりに、さまざまなサイズ、材質、鉄濃度、および用途をカバーする、2 つの商用ベンダーから十分に特徴付けられた一連の MP を選択しました。これは、最初に磁場がガラス毛細管内の MP の動きにどのような影響を与えるかを理解するためであり、次に、生きている気道。表面。MP のサイズは 0.25 ～ 18 µm と変化し、さまざまな材料で作られています (表 1 を参照) が、MP 内の磁性粒子のサイズを含む各サンプルの組成は不明です。私たちの広範な MCT 研究 19、20、21、23、24 に基づいて、たとえば連続フレームを減算して MP ​​の動きの視認性を向上させることにより、5 μm までの MP を気管気道表面で見ることができると期待しています。0.25μmというシングルMPは撮像素子の解像度より小さいですが、PB-PCXIはその体積コントラストや、堆積後の表面液体の動きを検出できることが期待されています。
表内の各 MP のサンプル。１は、内径０．６３ｍｍの２０μｌガラスキャピラリー（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ Ｍｉｃｒｏｃａｐｓ、ＰＡ、ＵＳＡ）中で調製した。微粒子粒子は水中で入手できますが、CombiMag 粒子はメーカー独自の液体中で入手できます。各チューブの半分は液体 (約 11 µl) で満たされ、サンプル ホルダー上に置かれます (図 1 を参照)。ガラス毛細管はそれぞれイメージング チャンバー内のステージ上に水平に配置され、液体の端に配置されました。希土類、ネオジム、鉄、ホウ素 (NdFeB) で作られた直径 19 mm (長さ 28 mm) のニッケルシェル磁石 (N35、カタログ番号 LM1652、Jaycar Electronics、オーストラリア) の残留磁気 1.17 T を、別の転送テーブルを使用して、レンダリング中に位置をリモートで変更できます。X 線イメージングは​​、磁石がサンプルの約 30 mm 上に配置されたときに開始され、画像は 4 フレーム/秒で取得されます。イメージング中、磁石をガラス毛細管に近づけ（約 1 mm の距離）、管に沿って移動させて磁場の強度と位置の影響を評価しました。
xy サンプルの移動段階でガラス毛細管内の MP サンプルを含む in vitro イメージング セットアップ。X 線ビームの経路は赤い点線でマークされます。
MP の in vitro 可視性が確立されると、そのサブセットを野生型雌 Wistar アルビノ ラット (~12 週齢、~200 g) で in vivo でテストしました。メデトミジン 0.24 mg/kg (Domitor®、Zenoaq、日本)、ミダゾラム 3.2 mg/kg (Dormicum®、アステラス製薬、日本)、およびブトルファノール 4 mg/kg (Vetorphale®、Meiji Seika)。ラットをファーマ（日本）混合物で腹腔内注射により麻酔した。麻酔後、気管周囲の毛を除去し、気管内チューブ（ET; 16 Ga 静脈カニューレ、テルモ BCT）を挿入し、サーマルバッグを含む特注のイメージング プレート上に仰臥位で固定することでイメージングの準備をしました。体温を維持するため。22. 次に、図 2a に示すように、X 線画像上で気管が水平になるように、イメージング プレートをイメージング ボックス内のサンプル ステージにわずかな角度で取り付けました。
(a) SPring-8 イメージング ユニットの in vivo イメージング セットアップ。X 線ビーム経路は赤い点線でマークされています。(b、c) 気管磁石の位置特定は、2 つの直交して取り付けられた IP カメラを使用して遠隔的に実行されました。画面上の画像の左側には、頭部を保持するワイヤー ループと ET チューブ内に取り付けられた送達カニューレが見えます。
100 μl ガラスシリンジを使用した遠隔制御シリンジ ポンプ システム (UMP2、World Precision Instruments、フロリダ州サラソータ) を、30 Ga 針を使用して PE10 チューブ (外径 0.61 mm、内径 0.28 mm) に接続しました。気管内チューブを挿入するときに先端が気管内の正しい位置にあることを確認するためにチューブにマークを付けます。マイクロポンプを使用して、シリンジプランジャーを取り外し、チューブの先端を送達するMPサンプルに浸しました。次に、装填された送達チューブを気管内チューブに挿入し、予想される印加磁場の最も強い部分に先端を配置しました。画像取得は、Arduino ベースのタイミング ボックスに接続された呼吸検出器を使用して制御され、すべての信号 (温度、呼吸、シャッターの開閉、画像取得など) は Powerlab および LabChart (AD Instruments、シドニー、オーストラリア) を使用して記録されました。 22 イメージング時 ハウジングが利用できない場合、2 台の IP カメラ (Panasonic BB-SC382) を互いに約 90° に配置し、イメージング中に気管に対する磁石の位置を制御するために使用しました (図 2b、c)。動きによるアーチファクトを最小限に抑えるために、終末呼吸流プラトー中に呼吸ごとに 1 つの画像を取得しました。
磁石は第 2 ステージに取り付けられており、撮像本体の外側に離れた位置に配置することができます。磁石のさまざまな位置と構成がテストされました。以下のものが含まれます。気管の上に約 30°の角度で配置されました (構成は図 2a および 3a に示されています)。1 つの磁石は動物の上に、もう 1 つは下にあり、磁極は引き付けられるように設定されています (図 3b)。、動物の上と下に 1 つの磁石があり、磁極は反発するように設定され (図 3c)、もう 1 つの磁石は気管の上に垂直に配置されます (図 3d)。動物と磁石をセットアップし、テスト対象の MP をシリンジ ポンプにロードした後、画像の取得時に 4 μl/秒の速度で 50 μl の用量を送達します。次に磁石は、画像の取得を続けながら、気管に沿って、または気管を横切って前後に移動します。
in vivo イメージング用の磁石構成 (a) 気管の上に約 30°の角度で 1 つの磁石、(b) 吸引用に構成された 2 つの磁石、(c) 反発用に構成された 2 つの磁石、(d) 気管の上に垂直に 1 つの磁石気管。観察者は口から気管を通って肺まで見下ろし、X 線ビームはラットの左側を通過して右側から出ました。磁石は、気道の長さに沿って移動するか、X 線ビームの方向に気管の上で左右に移動します。
また、呼吸と心拍数の混合がない場合の気道内の粒子の可視性と挙動を決定することも試みました。したがって、イメージング期間の終わりに、ペントバルビタールの過剰摂取により動物を人道的に安楽死させました（ソムノペンチル、ピットマンムーア、ワシントンクロッシング、米国; ～65 mg/kg ip）。一部の動物はイメージングプラットフォーム上に残され、呼吸と心拍が停止した後、気道表面に MP が見えない場合は追加の MP を追加してイメージングプロセスが繰り返されました。
得られた画像はフラット フィールドとダーク フィールドに対して補正され、MATLAB (R2020a、The Mathworks) で書かれたカスタム スクリプトを使用してムービー (1 秒あたり 20 フレーム、呼吸数に応じて 15 ～ 25 × 通常の速度) に組み立てられました。
LV 遺伝子ベクター送達に関するすべての研究は、アデレード大学実験動物研究センターで行われ、SPring-8 実験の結果を使用して、磁場の存在下での LV-MP 送達が in vivo での遺伝子導入を強化できるかどうかを評価することを目的としていました。 。MF と磁場の影響を評価するために、2 つのグループの動物を治療しました。1 つのグループには磁石を配置して LV MF を注射し、もう 1 つのグループには磁石を使用せずに LV MF を対照グループに注射しました。
LV 遺伝子ベクターは、以前に記載された方法 25、26 を使用して生成されています。LacZ ベクターは、MPSV 構成的プロモーター (LV-LacZ) によって駆動される核局在化β-ガラクトシダーゼ遺伝子を発現します。この遺伝子は、形質導入された細胞内で青色の反応生成物を生成し、肺組織の前面および切片に表示されます。力価をTU/mlで計算するために、血球計を使用してLacZ陽性細胞の数を手動で計数することによって、細胞培養物中で力価測定を行った。キャリアは-80℃で凍結保存され、使用前に解凍され、1:1で混合してCombiMagに結合され、配送前に少なくとも30分間氷上でインキュベートされます。
正常な Sprague Dawley ラット (n = 3/グループ、生後 1 か月で 0.4mg/kg メデトミジン (Domitor、Ilium、オーストラリア) と 60mg/kg ケタミン (Ilium、オーストラリア) の混合物で約 2 ～ 3 回腹腔内麻酔) 腹腔内）注射および 16 Ga 静脈カニューレを使用した非外科的経口カニューレ挿入。気管気道組織がLV形質導入を受けることを確実にするために、気管気道表面をワイヤーバスケット（N-Circle、チップなしのニチノール石抽出器NTSE-022115）-UDHで軸方向にこする、以前に説明した機械的摂動プロトコルを使用して調整しました。クック・メディカル、米国）30 p28。次に、バイオセーフティキャビネット内の混乱から約 10 分後に、LV-MP の気管投与が行われました。
この実験で使用された磁場は、生体内 X 線研究と同様に構成され、同じ磁石が蒸留ステント クランプで気管上に保持されました (図 4)。前述のように、ゲルチップ付きピペットを使用して、LV-MP 50 μl 容量 (2 x 25 μl アリコート 2 回) を気管 (n = 3 匹) に送達しました。対照群（n = 3 匹）には、磁石を使用せずに同じ LV-MP を投与しました。注入の完了後、カニューレが気管内チューブから除去され、動物は抜管される。磁石は 10 分間留まり、その後取り外されます。ラットにメロキシカム (1 ml/kg) (Ilium、オーストラリア) を皮下投与し、続いて 1 mg/kg 塩酸アティパマゾール (Antisedan、Zoetis、オーストラリア) の腹腔内注射により麻酔を解除しました。ラットを保温し、麻酔から完全に回復するまで観察した。
生物学的安全キャビネット内の LV-MP 送達デバイス。ET チューブのライトグレーのルアーロック スリーブが口から突き出ており、図に示すゲル ピペット チップが ET チューブを通して気管内の目的の深さまで挿入されていることがわかります。
LV-MP 投与手順の 1 週間後、動物を 100% CO2 吸入により人道的に屠殺し、当社の標準的な X-gal 処理を使用して LacZ 発現を評価しました。気管内チューブの留置による機械的損傷や体液貯留が分析に含まれないことを保証するために、最も尾側の 3 つの軟骨輪を除去しました。各気管を縦方向に切断して分析用に半分にし、ミニチュアン針（Fine Science Tools）を使用してシリコーンゴム（Sylgard、Dow Inc）を含むカップに置き、管腔表面を視覚化しました。形質導入された細胞の分布と性質は、DigiLite カメラと TCapture ソフトウェア (Tucsen Photonics、中国) を備えた Nikon 顕微鏡 (SMZ1500) を使用した正面写真によって確認されました。画像は 20 倍の倍率 (気管の全幅の最大設定を含む) で取得され、気管の全長が段階的に表示され、画像を「ステッチ」できるように各画像間に十分な重なりが提供されました。次に、Composite Image Editor バージョン 2.0.3 (Microsoft Research) を使用し、平面運動アルゴリズムを使用して、各気管からの画像を単一の合成画像に結合しました。 各動物の気管合成画像内の LacZ 発現領域は、前述のとおり 28、0.35 < Hue < 0.58、Saturation > 0.15、および Value < 0.7 の設定を使用して、自動 MATLAB スクリプト (R2020a、MathWorks) を使用して定量化されました。 各動物からの気管合成画像内の LacZ 発現領域は、前述のように 28、0.35 < 色相 < 0.58、彩度 > 0.15、および値 < 0.7 の設定を使用して、自動 MATLAB スクリプト (R2020a、MathWorks) を使用して定量化されました。 Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественно определена испол MATLAB (R2020a, MathWorks) を使用すると、0,35 <оттенок <0,58, を実行できます。 асыщенность> 0,15 и значение <0 、7。 各動物からの合成気管画像における LacZ 発現領域は、前述のように 28 0.35 の設定を使用して自動 MATLAB スクリプト (R2020a、MathWorks) を使用して定量化されました。0.15 および値 <0.7。前述したように、自動 MATLAB スクリプト (R2020a、MathWorks) を使用して、各動物の気管複合画像内の LacZ 発現領域を、0.35 < 0.58、色度 > 0.15、および値 < 0.7 の設定を使用して量化しました。如前所述、自动、自动自动自动matlab脚本脚本（r2020a、数学works））每只只的的气管复合图像图像图像量化使用0.35 <色调<0.58、> 0.15和值<0.7ヒップ Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно использование MATLAB (R2020a, MathWorks) を実行すると、0,35 <оттенок <0,58, ть> 0,15 и значение <0,7 。 各動物の気管の合成画像上の LacZ 発現領域は、0.35 < 色相 < 0.58、彩度 > 0.15、値 < 0.7 の設定を使用して、前述のように自動 MATLAB スクリプト (R2020a、MathWorks) を使用して定量化されました。GIMP v2.10.24 で組織の輪郭を追跡することにより、合成画像ごとにマスクが手動で作成され、組織領域を識別し、気管組織の外側での誤検出を防ぎました。各動物のすべての合成画像の染色領域を合計して、その動物の総染色領域を求めました。次に、ペイントされた領域をマスクの合計領域で割って、正規化された領域を取得しました。
各気管をパラフィンに包埋し、厚さ 5 μm の切片にしました。切片をニュートラルファストレッドで５分間対比染色し、Nikon Eclipse E400 顕微鏡、DS-Fi3 カメラ、および NIS 要素キャプチャ ソフトウェア (バージョン 5.20.00) を使用して画像を取得しました。
すべての統計分析は、GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.) で実行されました。統計的有意性は p ≤ 0.05 に設定されました。Shapiro-Wilk 検定を使用して正規性を検定し、対応のない t 検定を使用して LacZ 染色の差異を評価しました。
表 1 に記載されている 6 つの MP は PCXI によって検査されており、可視性は表 2 に記載されています。2 つのポリスチレン MP (MP1 と MP2、それぞれ 18 μm と 0.25 μm) は PCXI では確認できませんでしたが、残りのサンプルは識別できました。 (例を図 5 に示します)。MP3 と MP4 は弱く見えます (10 ～ 15% Fe3O4、それぞれ 0.25 μm と 0.9 μm)。MP5 (98% Fe3O4; 0.25 µm) には、テストした中で最も小さな粒子がいくつか含まれていましたが、最も顕著でした。CombiMag MP6 製品は見分けるのが困難です。すべての場合において、磁石をキャピラリと平行に前後に動かすことで、MF を検出する能力が大幅に向上しました。磁石がキャピラリーから離れると、粒子は長い鎖で引き出されますが、磁石が近づき、磁場の強度が増加すると、粒子がキャピラリーの上面に向かって移動するにつれて粒子の鎖は短くなります（補足ビデオS1を参照） : MP4)、表面の粒子密度が増加します。逆に、磁石がキャピラリーから取り外されると、磁場の強度が減少し、MP はキャピラリーの上面から伸びる長い鎖に再配置されます (補足ビデオ S2: MP4 を参照)。磁石の動きが止まっても、粒子は平衡位置に達してからしばらく動き続けます。MP がキャピラリーの上面に近づいたり遠ざかったりするにつれて、磁性粒子が液体中の破片を引き寄せる傾向があります。
PCXI での MP の可視性はサンプル間で大幅に異なります。(a) MP3、(b) MP4、(c) MP5、(d) MP6。ここに示されているすべての画像は、キャピラリーの真上約 10 mm に磁石を配置して撮影されました。見かけの大きな円は毛細管に閉じ込められた気泡であり、位相コントラスト画像の黒と白のエッジの特徴を明確に示しています。赤枠はコントラストを強調する倍率を示します。すべての図の磁気回路の直径は正確な縮尺ではなく、図示されている直径の約 100 倍であることに注意してください。
磁石がキャピラリの上部に沿って左右に動くと、MP ストリングの角度が磁石と整列するように変化し (図 6 を参照)、磁力線の輪郭が描かれます。MP3-5 の場合、弦がしきい値角度に達すると、粒子はキャピラリの上面に沿って引きずられます。これにより、磁場が最も強い場所の近くで MP がより大きなグループにクラスター化することがよくあります (補足ビデオ S3: MP5 を参照)。これは、キャピラリーの端近くをイメージングする場合にも特に顕著であり、これにより MP が液体と空気の界面で凝集して集中します。MP3-5 の粒子よりも区別するのが難しい MP6 の粒子は、磁石が毛細管に沿って移動したときに引きずられませんでしたが、MP ストリングが解離し、粒子が視界に残りました (補足ビデオ S4: MP6 を参照)。場合によっては、磁石を撮像部位から長距離移動して印加磁場を減少させると、残りの MP は重力によってゆっくりとチューブの底面に降下し、ストリング内に残りました (補足ビデオ S5: MP3 を参照)。 。
磁石がキャピラリの真上に移動すると、MP ストリングの角度が変化します。(a) MP3、(b) MP4、(c) MP5、(d) MP6。赤枠はコントラストを強調する倍率を示します。追加のビデオは、これらの静止画像では視覚化できない重要な粒子構造と動的情報を明らかにするための情報提供を目的としていることに注意してください。
私たちのテストでは、気管に沿って磁石をゆっくりと前後に動かすと、生体内での複雑な動きの状況における MF の視覚化が容易になることが示されました。ポリスチレンビーズ (MP1 および MP2) がキャピラリー内に見えなかったため、生体内試験は行われませんでした。残りの 4 つの MF はそれぞれ、垂直に対して約 30°の角度で気管上に配置された磁石の長軸を使用して生体内でテストされました (図 2b および 3a を参照)。これにより、MF チェーンが長くなり、より効果的になるためです。磁石よりも。。設定が終了しました。MP3、MP4、および MP6 は、生きた動物の気管内では見つかっていません。人道的に動物を殺した後にラットの気道を視覚化すると、シリンジポンプを使用して追加の量を加えた場合でも、粒子は見えないままでした。MP5 は酸化鉄含有量が最も高く、目に見える唯一の粒子であるため、生体内での MP の挙動を評価および特徴付けるために使用されました。
MF 挿入中に気管上に磁石を配置すると、すべてではありませんが、多くの MF が視野内に集中します。粒子の気管侵入は、人道的に安楽死させた動物で最もよく観察されます。図 7 および補足ビデオ S6: MP5 は、腹側気管の表面上の粒子の急速な磁気捕捉と整列を示し、MP が気管の所望の領域に標的化できることを示しています。MF 送達後に気管に沿ってさらに遠位方向を探索すると、一部の MF が気管分岐部の近くで見つかりました。これは、輸液投与中に最大磁場強度の領域を通って送達されたため、すべての MF を収集して保持するには磁場強度が不十分であることを示しています。プロセス。しかし、出生後の MP 濃度は画像領域付近でより高く、印加される磁場強度が最も高い気道領域に多くの MP が残留していることを示唆しています。
撮像領域の真上に磁石を配置して、最近安楽死させたラットの気管に MP5 を送達する前と (b) の画像。描かれた領域は 2 つの軟骨輪の間に位置します。MP が送達される前に、気道にはいくらかの液体が存在します。赤枠はコントラストを強調する倍率を示します。これらの画像は、S6: MP5 Supplementary Video で紹介されているビデオから取得したものです。
生体内で気管に沿って磁石を動かすと、毛細血管で観察されるものと同様に、気道表面上の MP チェーンの角度が変化しました (図 8 および補足ビデオ S7: MP5 を参照)。しかし、私たちの研究では、毛細血管のようにMPを生きている気道の表面に沿って引きずることはできませんでした。磁石が左右に動くとMPチェーンが伸びる場合があります。興味深いことに、磁石を気管に沿って縦方向に動かすと粒子鎖が流体の表層の深さを変化させ、磁石を真上に移動させて粒子鎖を垂直位置に回転させると粒子鎖が拡大することもわかりました。補足ビデオ S7)。: MP5 0:09、右下）。磁石が気管の上部を横切って横方向に（つまり、気管の長さに沿ってではなく、動物の左側または右側に）移動すると、特徴的な運動パターンが変化しました。粒子は移動中もはっきりと見えましたが、磁石が気管から取り外されると、粒子列の先端が見えるようになりました (補足ビデオ S8: MP5、0:08 からを参照)。これは、ガラス毛細管内に印加された磁場の作用下で観察された磁場の挙動と一致します。
麻酔をかけた生きたラットの気管内の MP5 を示すサンプル画像。(a) 磁石を使用して気管の上と左側の画像を取得し、次に (b) 磁石を右に移動した後。赤枠はコントラストを強調する倍率を示します。これらの画像は、S7 の補足ビデオ: MP5 で紹介されているビデオからのものです。
2つの極が気管の上下で南北方向に調整された場合（つまり、引き寄せ、図3b）、MPコードはより長く見え、気管の背側表面ではなく気管の側壁に位置していました。気管（付録を参照）。ビデオ S9:MP5)。しかし、二重磁石装置を使用した液体投与後、通常は単一磁石装置で発生する、1 つの部位 (すなわち、気管の背側表面) での高濃度の粒子は検出されませんでした。次に、1 つの磁石が反対の極を反発するように構成された場合 (図 3c)、視野内に見える粒子の数は送達後に増加しませんでした。2 つの磁石構成を両方とも設定することは、それぞれ磁石を引き付けるか押す磁場強度が高いため、困難です。次に、気道に平行であるが気道を 90 度の角度で通過する単一の磁石に設定を変更し、力線が気管壁を直角に横切るようにしました (図 3d)。この方向は気管壁上での粒子凝集の可能性を判断することを目的としています。側壁。観察されること。ただし、この構成では、識別可能な MF 蓄積の動きや磁石の動きはありませんでした。これらすべての結果に基づいて、遺伝子キャリアの in vivo 研究には、単一の磁石と 30 度の配向を備えた構成が選択されました (図 3a)。
人道的に屠殺された直後に動物を複数回画像化したところ、干渉する組織運動がないため、磁石の並進運動に応じて「揺れる」透明な軟骨間領域で、より細かく短い粒子線が識別できることがわかりました。MP6 粒子の存在と動きをはっきりと確認できます。
LV-LacZ の力価は 1.8 x 108 IU/mL で、CombiMag MP (MP6) と 1:1 で混合した後、動物に 9 x 107 IU/ml の LV ビヒクル (つまり 4.5 IU) の気管用量 50 μl を注射しました。 × 106 TU/ラット）。）。）。これらの研究では、分娩中に磁石を動かす代わりに、磁石を 1 つの位置に固定して、LV 伝達が (a) 磁場のない場合のベクター送達と比較して改善できるかどうか、(b) 気道が改善できるかどうかを判断しました。集中してください。細胞は上気道の磁気標的領域で形質導入されます。
磁石の存在や、LV ベクターと CombiMag を組み合わせた使用は、当社の標準的な LV ベクター送達プロトコルと同様に、動物の健康に悪影響を及ぼすようではありませんでした。機械的摂動を受けた気管領域の正面画像（補足図1）は、LV-MP治療グループが磁石の存在下で著しく高いレベルの伝達を示した（図9a）。対照群には少量の青色 LacZ 染色のみが存在しました (図 9b)。X-Gal染色された正規化領域の定量化により、磁場の存在下でのLV-MPの投与が約6倍の改善をもたらすことが示された(図9c)。
LV-MP による気管伝達を示す合成画像の例 (a) 磁場の存在下、(b) 磁石の非存在下。(c) 磁石の使用による気管内の LacZ 伝達の正規化領域の統計的に有意な改善 (*p = 0.029、t 検定、グループあたり n = 3、平均値 ± 平均値の標準誤差)。
中性の高速赤色染色切片（補足図2に示す例）は、LacZ染色細胞が以前に報告されたのと同じサンプルおよび同じ位置に存在することを示しました。
気道遺伝子治療における重要な課題は、依然として、対象領域における担体粒子の正確な位置特定と、気流および能動的な粘液除去の存在下での移動性肺における高レベルの形質導入効率の達成である。嚢胞性線維症における呼吸器疾患の治療を目的とした左室キャリアの場合、伝導性気道におけるキャリア粒子の滞留時間を長くすることは、これまで達成不可能な目標であった。Castellaniらによって指摘されているように、形質導入を強化するための磁場の使用は、単純さ、経済性、局所的な送達、効率の向上、およびインキュベーション時間の短縮を組み合わせることができるため、エレクトロポレーションなどの他の遺伝子送達方法よりも利点があります。そしておそらくはより低い用量のビヒクル10。しかし、外部磁力の影響下での気道における磁性粒子の in vivo での沈着と挙動についてはこれまで一度も記載されておらず、実際、無傷の生きた気道における遺伝子発現レベルを増加させるこの方法の能力は in vivo で実証されていない。
PCXI シンクロトロンでの in vitro 実験では、MP ポリスチレンを除いて、テストしたすべての粒子が、使用したイメージング設定で可視であることがわかりました。磁場の存在下では、磁場は糸を形成し、その長さは粒子の種類と磁場の強さ (つまり、磁石の接近と動き) に関係します。図 10 に示すように、個々の粒子が磁化されて独自の局所磁場が誘導されると、私たちが観察する弦が形成されます。これらの別々の場により、他の同様の粒子が集まり、他の粒子の局所的な引力と反発力による局所的な力によってグループ ストリングの運動と結合します。
(a、b) 液体で満たされた毛細血管内で形成される粒子の鎖と (c、d) 空気で満たされた気管を示す図。毛細血管と気管は一定の縮尺で描かれていないことに注意してください。パネル (a) には、鎖状に配置された Fe3O4 粒子を含む MF の説明も含まれています。
磁石がキャピラリー上を移動すると、粒子列の角度が Fe3O4 を含む MP3-5 の臨界閾値に達し、その後粒子列は元の位置に留まらず、表面に沿って新しい位置に移動しました。磁石。この効果は、ガラス毛細管の表面がこの動きを可能にするほど十分に滑らかであるために発生すると考えられます。興味深いことに、MP6 (CombiMag) はこのように挙動しませんでした。これは、おそらく粒子が小さいため、コーティングや表面電荷が異なるため、または独自のキャリア流体が粒子の移動能力に影響を与えたためと考えられます。CombiMag 粒子画像のコントラストも弱く、液体と粒子が同じ密度を持っているため、互いに向かって簡単に移動できない可能性があることを示唆しています。磁石の動きが速すぎる場合にも粒子が引っかかる可能性があり、磁場の強さが流体中の粒子間の摩擦に常に打ち勝つことができないことを示しており、磁場の強さと磁石とターゲット領域の間の距離が適切な値になるべきではないことを示唆しています。驚き。重要。これらの結果は、磁石は標的領域を流れる多くの微粒子を捕捉できるものの、CombiMag 粒子を気管の表面に沿って移動させるのに磁石を信頼できる可能性は低いことも示しています。したがって、我々は、in vivo LV MF 研究では、気道樹の特定の領域を物理的に標的とするために静磁場を使用する必要があると結論付けました。
粒子が体内に送られると、体内の複雑に動く組織の中で粒子を識別することは困難ですが、磁石を気管上で水平に移動させて MP ​​ストリングを「小刻みに動かす」ことで、粒子の検出能力が向上しました。リアルタイムのイメージングは​​可能ですが、動物を人道的に殺した後の粒子の動きを識別する方が簡単です。MP 濃度は通常、磁石が撮像領域上に配置された場合、この位置で最も高くなりますが、一部の粒子は通常、気管のさらに下で見つかりました。in vitro 研究とは異なり、磁石の動きによって粒子を気管内に引きずり込むことはできません。この発見は、気管の表面を覆う粘液が通常、吸入された粒子をどのように処理し、粘液内に捕捉し、その後粘膜毛様体クリアランス機構を通じて粒子を除去するかということと一致している。
私たちは、吸引のために気管の上下に磁石を使用すると (図 3b)、一点に高度に集中した磁場ではなく、より均一な磁場が得られ、粒子のより均一な分布が得られる可能性があると仮説を立てました。。しかし、私たちの予備調査では、この仮説を裏付ける明確な証拠は見つかりませんでした。同様に、一対の磁石を反発するように設定しても (図 3c)、画像領域内に粒子がさらに沈降することはありませんでした。これら 2 つの発見は、二重磁石の設定では MP ポインティングの局所制御が大幅に改善されないこと、および結果として生じる強力な磁力の調整が困難であるため、このアプローチが実用的ではないことを示しています。同様に、気管の上および気管を横切るように磁石を配向しても (図 3d)、画像化された領域に残る粒子の数は増加しませんでした。これらの代替構成の一部は、堆積ゾーン内の磁場強度の低下を招くため、成功しない可能性があります。したがって、30 度の単一磁石構成 (図 3a) が、最も単純で効率的な in vivo 検査方法と考えられます。
LV-MP 研究では、LV ベクターを CombiMag と組み合わせ、磁場の存在下で物理的に妨害した後に送達すると、コントロールと比較して気管内の形質導入レベルが大幅に増加することが示されました。シンクロトロンイメージング研究と LacZ の結果に基づいて、磁場は LV を気管内に維持し、肺の深部に直ちに侵入するベクター粒子の数を減らすことができると考えられます。このようなターゲティングの改善は、送達力価、非ターゲティング形質導入、炎症性および免疫性の副作用、および遺伝子導入コストを削減しながら、効率の向上につながる可能性があります。重要なのは、製造業者によると、CombiMag は他のウイルスベクター (AAV など) や核酸などの他の遺伝子導入方法と組み合わせて使用​​できることです。