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トキソプラズマ ゴンディは、感染した宿主の微小環境を調節する細胞内寄生原虫であり、脳腫瘍の増殖の発生率と関連していることが知られています。この研究では、トキソプラズマ感染によるエキソソーム miRNA-21 が脳腫瘍の増殖を促進するという仮説を立てています。トキソプラズマに感染した BV2 ミクログリアのエキソソームの特性が解析され、U87 神経膠腫細胞の内部移行が確認されました。トキソプラズマ ゴンディおよび腫瘍選別に関連するマイクロ RNA およびマイクロ RNA-21A-5p のアレイを使用して、エキソソーム マイクロ RNA 発現プロファイルを分析しました。また、エキソソームの miR-21 レベルを変化させることにより、U87 神経膠腫細胞の腫瘍関連遺伝子の mRNA レベルと、ヒト U87 神経膠腫細胞の増殖に対するエキソソームの影響を調査しました。トキソプラズマ ゴンディに感染した U87 神経膠腫細胞のエキソソームでは、microRNA-21 の発現が増加し、抗腫瘍遺伝子 (FoxO1、PTEN、PDCD4) の活性が低下します。トキソプラズマに感染した BV2 由来のエキソソームは、U87 神経膠腫細胞の増殖を誘導します。エクソソームは、マウス腫瘍モデルにおいて U87 細胞の増殖を誘導します。われわれは、トキソプラズマ感染BV2ミクログリアにおけるエキソソームmiR-21の増加が、抗腫瘍遺伝子を下方制御することによってU87神経膠腫細胞における細胞増殖促進因子として重要な役割を果たしている可能性があることを示唆する。
2018 年には世界中で 1,810 万件以上の進行がんが診断され、毎年約 297,000 件の中枢神経系腫瘍（全腫瘍の 1.6%）が診断されていると推定されています1。これまでの研究では、ヒトの脳腫瘍を発症する危険因子には、さまざまな化学製品、家族歴、頭部治療および診断機器からの電離放射線が含まれることが示されています。しかし、これらの悪性腫瘍の正確な原因は不明です。世界中のすべてのがんの約 20% は、ウイルス、細菌、寄生虫などの感染因子によって引き起こされます 3,4。感染性病原体は、DNA 修復や細胞周期などの宿主細胞の遺伝的メカニズムを破壊し、慢性炎症や免疫系の損傷を引き起こす可能性があります5。
ヒトのがんに関連する感染性病原体は、ヒトパピローマウイルスや B 型肝炎ウイルス、C 型肝炎ウイルスなど、最も一般的なウイルス病原体です。寄生虫は、人間のがんの発症にも潜在的な役割を果たす可能性があります。いくつかの寄生虫種、すなわち住血吸虫、オピホルキス・ヴィヴェリーニ、O. ネコ科動物、クロノキス・シネンシスおよびヒメノレピス・ナナは、さまざまな種類のヒトの癌に関与していると考えられています6、7、8。
トキソプラズマ ゴンディは、感染した宿主細胞の微小環境を調節する細胞内原虫です。この寄生虫は世界人口の約 30% に感染すると推定されており、全人口が危険にさらされています 9,10。トキソプラズマ・ゴンディは、中枢神経系（CNS）を含む重要な器官に感染し、特に免疫不全患者において致死性の髄膜炎や脳炎などの重篤な病気を引き起こす可能性があります9。しかし、トキソプラズマ ゴンディは、免疫正常個体の細胞増殖と免疫反応を調節することにより、感染した宿主の環境を変化させ、無症候性の慢性感染の維持につながる可能性もあります9,11。興味深いことに、T. gondii の罹患率と脳腫瘍の発生率との相関関係を考慮すると、慢性 T. gondii 感染による in vivo 宿主環境の変化が腫瘍微小環境に似ていることを示唆する報告もいくつかあります。
エキソソームは、タンパク質や核酸などの生物学的内容物を隣接する細胞から伝達する細胞間伝達物質として知られています 16、17。エキソソームは、腫瘍微小環境における抗アポトーシス、血管新生、転移などの腫瘍関連の生物学的プロセスに影響を与える可能性があります。特に、長さ約 22 ヌクレオチドの小さな非コード RNA である miRNA (miRNA) は、miRNA 誘導サイレンシング複合体 (miRISC) を通じてヒト mRNA の 30% 以上を制御する重要な転写後遺伝子制御因子です。トキソプラズマ ゴンディは、感染した宿主における miRNA 発現を制御することによって生物学的プロセスを破壊する可能性があります。宿主 miRNA には、寄生虫の生存戦略を達成するために宿主の生物学的プロセスを制御するための重要なシグナルが含まれています。したがって、T. gondii 感染時の宿主 miRNA プロファイルの変化を研究することは、宿主と T. gondii の間の相互作用をより明確に理解するのに役立ちます。確かに、Thirugnanam et al.15 人は、T. gondii が腫瘍増殖に関連する特定の宿主 miRNA 上の発現を変化させることによって脳の発癌を促進することを示唆し、T. gondii が実験動物において神経膠腫を引き起こす可能性があることを発見した。
この研究は、トキソプラズマ BV2 に感染した宿主ミクログリアにおけるエキソソーム miR-21 の変化に焦点を当てています。我々は、過剰発現されたmiR-21の標的であるFoxO1/p27の核内での保持に起因する、U87神経膠腫細胞の増殖における変化したエキソソームmiR-21の役割の可能性を観察した。
BV2 由来のエクソソームは分画遠心分離を使用して取得され、細胞成分や他の小胞の汚染を防ぐためのさまざまな方法で検証されました。SDS ポリアクリルアミド ゲル電気泳動 (SDS-PAGE) では、BV2 細胞とエキソソームから抽出されたタンパク質の間に明確なパターンが示され (図 1A)、サンプルの Alix の存在が評価されました。これは、エクソソーム タンパク質 マーカーのウェスタン ブロッティングによって分析されました。Alix 標識はエキソソームタンパク質では見つかりましたが、BV2 細胞溶解物タンパク質では見つかりませんでした (図 1B)。さらに、BV2 由来のエクソソームから精製した RNA をバイオアナライザーを使用して分析しました。18S および 28S リボソーム サブユニットはエクソソーム RNA 移動パターンではほとんど観察されず、信頼性の高い純度が示されました (図 1C)。最後に、透過型電子顕微鏡により、観察されたエクソソームのサイズは約 60 ～ 150 nm で、エクソソームの形態に典型的なカップ状の構造をしていることが示されました (図 1D)。
BV2 細胞由来のエクソソームの特性評価。(A) 安全データシートのページ。タンパク質は、BV2 細胞または BV2 由来のエキソソームから単離されました。タンパク質のパターンは細胞とエクソソームの間で異なります。(B) エクソソームマーカー (Alix) のウェスタンブロット分析。(C) バイオアナライザーを使用した、BV2 細胞および BV2 由来エキソソームからの精製 RNA の評価。したがって、BV2 細胞の 18S および 28S リボソーム サブユニットは、エクソソーム RNA ではほとんど見つかりませんでした。(D) 透過型電子顕微鏡検査により、BV2 細胞から単離されたエキソソームが 2% 酢酸ウラニルでネガティブに染色されたことが示されました。エクソソームは、サイズが約 60 ～ 150 nm で、カップの形をしています (Song と Jung、未発表データ)。
BV2 由来エキソソームの U87 ヒト神経膠腫細胞への細胞内在化が、共焦点顕微鏡を使用して観察されました。PKH26 標識エキソソームは、U87 細胞の細胞質に局在しています。核は DAPI で染色されました (図 2A)。これは、BV2 由来のエキソソームが宿主細​​胞によって内部移行され、レシピエント細胞の環境に影響を与える可能性があることを示しています。
BV2 由来エキソソームの U87 神経膠腫細胞への取り込み、およびトキソプラズマ RH に感染した BV2 由来エキソソームは U87 神経膠腫細胞の増殖を誘導しました。(A) 共焦点顕微鏡で測定した、U87 細胞に飲み込まれたエキソソーム。U87 神経膠腫細胞を、PKH26 (赤色) で標識されたエキソソームまたはコントロールなしで標識されたエキソソームとともに 24 時間インキュベートしました。核をDAPI（青色）で染色し、共焦点顕微鏡（スケールバー：10μm、×3000）で観察した。(B) U87 神経膠腫細胞の増殖は、細胞増殖アッセイによって測定されました。U87 神経膠腫細胞を、指定された時間エキソソームで処理しました。 *P < 0.05 はスチューデントの t 検定によって得られました。 *P < 0.05 はスチューデントの t 検定によって得られました。 *P < 0,05 получено по t-критерию Стьюдента. *スチューデントの t 検定による P < 0.05。 *P < 0.05 は学生の検査によって得られました。 *P < 0.05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * スチューデントの t 検定を使用して得られた P < 0.05。
BV2 由来エキソソームの U87 神経膠腫細胞への内在化を確認した後、細胞増殖アッセイを実施して、ヒト神経膠腫細胞の発生における BV2 由来トキソプラズマ由来エキソソームの役割を調査しました。T. ゴンディ感染 BV2 細胞由来のエキソソームによる U87 細胞の処理により、T. ゴンディ感染 BV2 由来エキソソームが対照と比較して U87 細胞の有意に高い増殖を引き起こすことが示されました (図 2B)。
さらに、トキソプラズマで刺激されたエキソソームが最高レベルの増殖を引き起こしたため、U118 細胞の増殖は U87 と同じ結果となりました (データは示さず)。これらのデータに基づいて、BV2 由来のトキソプラズマに感染したエクソソームが神経膠腫細胞の増殖において重要な役割を果たしていることがわかります。
腫瘍発生に対するトキソプラズマ感染BV2由来エキソソームの影響を調査するために、異種移植モデル用のヌードマウスにU87神経膠腫細胞を注入し、BV2由来エキソソームまたはRH感染BV2由来エキソソームを注入しました。1週間後に腫瘍が明らかになった後、5匹のマウスからなる各実験グループを腫瘍サイズに従って分けて同じ開始点を決定し、腫瘍サイズを22日間測定した。
U87異種移植モデルのマウスでは、22日目にBV2由来RH感染エキソソーム群で有意に大きな腫瘍サイズと重量が観察されました（図3A、B）。一方、エクソソーム処理後のBV2由来エキソソーム群と対照群との間で腫瘍サイズに有意差は認められなかった。さらに、神経膠腫細胞とエキソソームを注射したマウスは、RH 感染 BV2 由来エキソソームのグループの中で最大の腫瘍体積を視覚的に示しました (図 3C)。これらの結果は、BV2 由来のトキソプラズマに感染したエキソソームがマウス腫瘍モデルにおいて神経膠腫の増殖を誘導することを示しています。
U87異種移植マウスモデルにおけるBV2由来エキソソームの発癌（AC）。BV2 由来の RH 感染エキソソームで治療した BALB/c ヌードマウスでは、腫瘍サイズ (A) と重量 (B) が有意に増加しました。BALB/c ヌードマウス (C) に、マトリゲル混合物に懸濁した 1 x 10 7 個の U87 細胞を皮下注射しました。注射から 6 日後、100 μg の BV2 由来エキソソームをマウスに投与しました。腫瘍のサイズと重量は、それぞれ示された日と屠殺後に測定されました。 *P < 0.05。 *P < 0.05。 *Р < 0.05。 *P < 0.05。 *P < 0.05。 *P < 0.05。 *Р < 0.05。 *P < 0.05。
データは、免疫または腫瘍の発生に関連する 37 個の miRNA (16 個が過剰発現、21 個がダウン発現) が、トキソプラズマ RH 株感染後のミクログリアで大幅に変化したことを示しました (図 4A)。改変された miRNA 間の miR-21 の相対的な発現レベルは、BV2 由来のエキソソーム、BV2 および U87 細胞で処理したエキソソームにおけるリアルタイム RT-PCR によって確認されました。miR-21の発現は、トキソプラズマ・ゴンディ（RH株）に感染したBV2細胞からのエキソソームの有意な増加を示した（図4B）。BV2細胞およびU87細胞におけるmiR-21の相対発現レベルは、変化したエキソソームの取り込み後に増加しました（図4B）。腫瘍患者およびトキソプラズマ・ゴンディ（ME49株）に感染したマウスの脳組織におけるmiR-21発現の相対レベルは、それぞれ対照よりも高かった（図4C）。これらの結果は、in vitro および in vivo での予測および確認されたマイクロ RNA の発現レベル間の差異と相関しています。
トキソプラズマ・ゴンディ（RH）に感染したミクログリアにおけるエクソソームmiP-21a-5pの発現の変化。(A) T. gondii RH 感染後の免疫または腫瘍の発生に関連する siRNA の重大な変化を示します。(B) 相対的な miR-21 発現レベルは、BV2 由来エキソソーム、BV2 処理エキソソーム、および U87 細胞におけるリアルタイム RT-PCR によって検出されました。(C) 相対的な miR-21 発現レベルは、腫瘍患者 (N = 3) およびトキソプラズマ ゴンディ (ME49 株) に感染したマウス (N = 3) の脳組織で見つかりました。 *P < 0.05 はスチューデントの t 検定によって得られました。 *P < 0.05 はスチューデントの t 検定によって得られました。 *P < 0,05 は、 помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0.05 は、Student の t 検定を使用して得られました。 *P < 0.05 は学生の検査によって得られました。 *P < 0.05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * スチューデントの t 検定を使用して得られた P < 0.05。
RH に感染した BV2 細胞からのエキソソームは、インビボおよびインビトロで神経膠腫の増殖を引き起こしました (図 2、3)。関連する mRNA を検出するために、BV2 または RH BV2 由来のエキソソームに感染した U87 細胞における抗腫瘍標的遺伝子、フォークヘッド ボックス O1 (FoxO1)、PTEN、およびプログラム細胞死 4 (PDCD4) の mRNA レベルを調べました。バイオインフォマティクス分析により、FoxO1、PTEN、PDCD4 遺伝子を含むいくつかの腫瘍関連遺伝子に miR-2121,22 結合部位があることが示されました。抗腫瘍標的遺伝子のmRNAレベルは、BV2由来エキソソームと比較して、RH感染BV2由来エキソソームにおいて減少した(図5A)。FoxO1 は、BV2 由来エキソソームと比較して、RH 感染 BV2 由来エキソソームのタンパク質レベルの低下を示しました (図 5B)。これらの結果に基づいて、RH に感染した BV2 に由来するエキソソームが抗癌遺伝子を下方制御し、腫瘍増殖における役割を維持していることを確認できました。
トキソプラズマ RH 感染 BV2 由来エキソソームは、トキソプラズマ RH 感染 BV2 由来エキソソームによって U87 神経膠腫細胞の抗腫瘍遺伝子の抑制を誘導します。(A) PBS エキソソームと比較した、T. gondii RH 感染 BV2 由来のエキソソームにおける FoxO1、PTEN、および PDCD4 発現のリアルタイム PCR。β-アクチン mRNA をコントロールとして使用しました。(B) FoxO1 発現はウェスタンブロッティングによって決定され、濃度測定データは ImageJ プログラムを使用して統計的に評価されました。 *P < 0.05 はスチューデントの t 検定によって得られました。 *P < 0.05 はスチューデントの t 検定によって得られました。 *P < 0,05 は、 помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0.05 は、Student の t 検定を使用して得られました。 *P < 0.05 は学生の検査によって得られました。 *P < 0.05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * スチューデントの t 検定を使用して得られた P < 0.05。
腫瘍関連遺伝子制御に対するエキソソーム中の miP-21 の影響を理解するために、Lipofectamine 2000 を使用して U87 細胞に miP-21 阻害剤をトランスフェクトし、トランスフェクションの 24 時間後に細胞を回収しました。miR-21阻害剤をトランスフェクトした細胞におけるFoxO1およびp27の発現レベルを、qRT-PCRを用いてBV2由来エキソソームで処理した細胞と比較しました（図6A、B）。miR-21阻害剤のU87細胞へのトランスフェクションは、FoxO1およびp27発現を有意に下方制御した(図6)。
RH感染エキソソームBV2由来miP-21は、U87神経膠腫細胞におけるFoxO1/p27発現を変化させた。U87 細胞を、リポフェクタミン 2000 を使用して miP-21 阻害剤でトランスフェクトし、トランスフェクションの 24 時間後に細胞を回収しました。miR-21 阻害剤をトランスフェクトした細胞における FoxO1 および p27 の発現レベルを、qRT-PCR を使用して BV2 由来エキソソームで処理した細胞におけるレベルと比較しました (A、B)。
宿主の免疫反応から逃れるために、トキソプラズマ寄生虫は組織嚢胞に変化します。それらは、宿主の生涯を通じて、脳、心臓、骨格筋などのさまざまな組織に寄生し、宿主の免疫応答を調節します。さらに、それらは宿主細胞の細胞周期とアポトーシスを調節し、その増殖を促進することができます14,24。トキソプラズマ ゴンディは主に宿主の樹状細胞、好中球、および脳ミクログリアを含む単球/マクロファージ系統に感染します。トキソプラズマ ゴンディは、M2 表現型のマクロファージの分化を誘導し、病原体感染後の創傷治癒に影響を与え、血管過多および肉芽腫性線維症にも関連します。トキソプラズマ感染のこの行動病因は、腫瘍の発生に関連するマーカーに関連している可能性があります。トキソプラズマによって制御される過酷な環境は、対応する前がん状態に似ている可能性があります。したがって、トキソプラズマ感染が脳腫瘍の発症に寄与していると考えられます。実際、さまざまな脳腫瘍患者の血清中に、高率のトキソプラズマ感染が報告されています。さらに、トキソプラズマ ゴンディは別の発がん性エフェクターである可能性があり、他の感染性発がん物質が脳腫瘍を発症するのを助けるために相乗的に作用する可能性があります。この点に関して、熱帯熱マラリア原虫とエプスタイン・バーウイルスが相乗的にバーキットリンパ腫の形成に寄与していることは注目に値します。
がん研究分野における調節因子としてのエクソソームの役割は、広範囲に研究されています。しかし、寄生虫と感染した宿主の間でのエクソソームの役割はまだよくわかっていません。これまでのところ、分泌タンパク質を含むさまざまな調節因子によって、寄生原虫が宿主の攻撃に抵抗し、感染を永続させる生物学的プロセスが説明されてきた。最近、原生動物に関連する微小胞とそのマイクロRNAが宿主細胞と相互作用して、それらの生存に好ましい環境を作り出すという概念が広まってきています。したがって、変化したエキソソーム miRNA と神経膠腫細胞の増殖との関係を発見するには、さらなる研究が必要です。マイクロ RNA の変化（クラスター遺伝子 miR-30c-1、miR-125b-2、miR-23b-27b-24-1、miR-17-92）は、トキソプラズマに感染したヒトマクロファージの STAT3 プロモーターに結合し、調節され、抗ウイルス作用を誘導します。 -トキソプラズマ・ゴンディ感染に反応したアポトーシス 29．トキソプラズマ感染は、いくつかの過剰増殖性疾患に関連する miR-17-5p および miR-106b-5p の発現を増加させます 30 。これらのデータは、トキソプラズマ感染によって調節される宿主 miRNA が、寄生虫の生存と宿主の生物学的行動の病因にとって重要な分子であることを示唆しています。
変化した miRNA は、神経膠腫を含む悪性細胞の発生および進行中のさまざまなタイプの挙動に影響を与える可能性があります。増殖シグナルの自給自足、増殖阻害シグナルに対する非感受性、アポトーシス回避、無限の複製能、血管新生、浸潤および転移、炎症などです。神経膠腫では、いくつかの発現プロファイリング研究で miRNA の変化が確認されています。
本研究では、トキソプラズマに感染した宿主細胞において高レベルの miRNA-21 発現が確認されました。miR-21 は、神経膠腫を含む固形腫瘍で最も頻繁に過剰発現される microRNA の 1 つであることが確認されており 33、その発現は神経膠腫のグレードと相関しています。蓄積されている証拠は、miR-21 が神経膠腫の増殖において抗アポトーシス因子として作用し、ヒト脳悪性腫瘍の組織および血漿中で高度に過剰発現する新規癌遺伝子であることを示唆しています。興味深いことに、神経膠腫の細胞および組織における miR-21 の不活化は、カスパーゼ依存性のアポトーシスによる細胞増殖の阻害を引き起こします。miR-21 の予測標的のバイオインフォマティクス分析により、プログラム細胞死 4 (PDCD4)、トロポミオシン (TPM1)、PTEN、フォークヘッド ボックス O1 (FoxO1) など、アポトーシス経路に関連する複数の腫瘍抑制遺伝子と miR-2121 結合部位が明らかになりました。.22.38。
FoxO1 は、転写因子 (FoxO) の 1 つとして、さまざまな種類のヒトがんの発生に関与しており、p21、p27、Bim、FasL40 などの腫瘍抑制遺伝子の発現を調節できます。FoxO1 は、p27 などの細胞周期阻害剤に結合して活性化し、細胞増殖を抑制します。さらに、FoxO1 は PI3K/Akt シグナル伝達の重要なエフェクターであり、p2742 転写の活性化を通じて細胞周期の進行や細胞分化などの多くの生物学的プロセスを制御します。
結論として、我々は、トキソプラズマ感染ミクログリア由来のエキソソーム miR-21 が神経膠腫細胞の増殖調節因子として重要な役割を果たしている可能性があると考えています (図 7)。ただし、エキソソーム miR-21、トキソプラズマ感染の変化、および神経膠腫の増殖の間の直接的な関連性を見つけるには、さらなる研究が必要です。これらの結果は、トキソプラズマ感染と神経膠腫の発生率との関係を研究するための出発点となることが期待されます。
この研究では、神経膠腫 (脳) の発がんメカニズムの概略図が提案されています。著者は PowerPoint 2019 (マイクロソフト、ワシントン州レドモンド) で描画しています。
動物の使用を含むこの研究のすべての実験プロトコルは、ソウル国立大学動物管理およびユーザー委員会の標準倫理ガイドラインに従っており、ソウル国立大学医学部の治験審査委員会によって承認されました（治験審査委員会番号 SNU- 150715）。-2)。すべての実験手順は、ARRIVE の推奨事項に従って実行されました。
BV2 マウスミクログリアおよび U87 ヒト神経膠腫細胞を、それぞれ 10% ウシ胎児血清、4 mM l-グルタミン、0.2 mM ペニシリン、および 0.05 mM ストレプトマイシン。細胞は、5% CO2、37℃のインキュベーター内で培養されました。別の神経膠腫細胞株である U118 を U87 細胞との比較に使用しました。
T. ゴンディに感染した RH 株および ME49 株からエキソソームを単離するために、3 ～ 4 日前に注射した生後 6 週齢の BALB/c マウスの腹腔から T. ゴンディ タキゾイト (RH 株) を採取しました。タキゾイトを PBS で 3 回洗浄し、40% Percoll (Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国) での遠心分離によって精製しました。ME49株のタキゾイトを取得するために、BALB/cマウスに20個の組織嚢胞を腹腔内注射し、感染後6〜8日目に腹腔を洗浄することによって嚢胞内のタキゾイト形質転換を収集した(PI)。PBSに感染したマウス。ME49 タキゾイトは、100 μg/ml ペニシリン (Gibco/BRL、米国ニューヨーク州グランドアイランド)、100 μg/ml ストレプトマイシン (Gibco/BRL)、および 5% ウシ胎児血清 (Lonza、メリーランド州ウォーカーズビル) を補充した細胞で増殖させました。 。., USA)、37 °C、5% 二酸化炭素で。Vero 細胞で培養した後、ME49 タキゾイトを 25 ゲージの針に 2 回通し、次に 5 μm フィルターに通して破片と細胞を除去しました。洗浄後、タキゾイトをPBS44に再懸濁した。トキソプラズマ ゴンディ ME49 株の組織嚢胞は、感染した C57BL/6 マウス (Orient Bio Animal Center、城南、韓国) の脳から単離された嚢胞の腹腔内注射によって維持されました。ME49 感染マウスの脳を 3 か月の PI 後に採取し、顕微鏡下で細かく切り刻んで嚢胞を分離しました。感染したマウスは、ソウル大学医学部で特別な無病原体条件（SPF）下で飼育された。
溶出ステップのインキュベーション時間を含むメーカーの指示に従って、miRNeasy Mini Kit (Qiagen、ヒルデン、ドイツ) を使用して、BV2 由来エキソソーム、BV2 細胞および組織から全 RNA を抽出しました。RNA濃度はNanoDrop 2000分光光度計で測定しました。RNA マイクロアレイの品質は、Agilent 2100 バイオアナライザー (Agilent Technologies、アムステルフェーン、オランダ) を使用して評価しました。
10% エキソソームの少ない FBS を含む DMEM を、4℃、100,000 g で 16 時間の超遠心分離によって調製し、0.22 μm フィルター (Nalgene、米国ニューヨーク州ロチェスター) で濾過しました。BV2 細胞 5 × 105 個を、10% エキソソーム除去 FBS および 1% 抗生物質を含む DMEM 中で 37°C、5% CO2 で培養しました。24 時間のインキュベーション後、RH 株または ME49 株 (MOI = 10) のタキゾイトを細胞に添加し、非侵入寄生虫を 1 時間以内に除去し、DMEM を再充填しました。BV2 細胞からのエクソソームは、最も広く使用されている方法である改良分画遠心分離によって単離されました。RNA またはタンパク質の分析のために、エクソソーム ペレットを 300 μl PBS に再懸濁します。単離されたエキソソームの濃度は、BCA タンパク質アッセイ キット (Pierce、米国イリノイ州ロックフォード) および NanoDrop 2000 分光光度計を使用して測定されました。
BV2 細胞または BV2 由来のエキソソームからの沈殿を PRO-PREP™ タンパク質抽出溶液 (iNtRon Biotechnology、城南、韓国) で溶解し、タンパク質をクーマシー ブリリアント ブルー染色した 10% SDS ポリアクリルアミドゲルにロードしました。さらに、タンパク質を 2 時間かけて PVDF 膜に転写しました。ウェスタンブロットは、エキソソームマーカーとして Alix 抗体 (Cell Signaling Technology、米国マサチューセッツ州ビバリー) を使用して検証されました。HRP 結合ヤギ抗マウス IgG (H + L) (Bether Laboratories、モンゴメリー、テキサス州、米国) および LAS-1000 plus 発光画像分析装置 (富士写真フィルム、東京、日本) を二次抗体として使用しました。。エキソソームのサイズと形態を研究するために透過型電子顕微鏡検査が行われました。BV2 細胞から単離したエキソソーム (6.40 μg/μl) をカーボンコートメッシュ上で調製し、2% 酢酸ウラニルで 1 分間ネガティブ染色しました。調製されたサンプルは、ES1000W Erlangshen CCD カメラ (Gatan、プレザントン、カリフォルニア州、米国) を備えた JEOL 1200-EX II (東京、日本) を使用して、80 kV の加速電圧で観察されました。
BV2 由来エキソソームは、PKH26 赤色蛍光リンカー キット (Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国) を使用して室温で 15 分間染色しました。PKH26 標識エキソソーム (赤色) を含む、または陰性対照としてエクソソームを含まない U87 細胞 (2 × 105) を、5% CO2 インキュベーター内で 37℃ で 24 時間インキュベートしました。U87 細胞核を DAPI (青) で染色し、U87 細胞を 4% パラホルムアルデヒドで 4°C で 15 分間固定し、次に Leica TCS SP8 STED CW 共焦点顕微鏡システム (Leica Microsystems、マンハイム、ドイツ) で分析しました。観察可能な。
Mir-X siRNA第一鎖合成およびSYBR qRT-PCRキット（タカラバイオ株式会社、滋賀県）を使用して、siRNAからcDNAを合成しました。リアルタイム定量的 PCR は、SYBR Premix と混合したプライマーとテンプレートを使用して、iQ5 リアルタイム PCR 検出システム (Bio-Rad、Hercules、CA、USA) を使用して実行されました。DNAは、95℃で15秒間の変性と60℃で60秒間のアニーリングの40サイクルで増幅されました。各 PCR 反応からのデータは、iQ™5 光学システム ソフトウェア (Bio-Rad) のデータ分析モジュールを使用して分析されました。選択した標的遺伝子とβ-アクチン/siRNA (および U6) の間の遺伝子発現の相対的な変化を、標準曲線法を使用して計算しました。使用したプライマー配列を表 1 に示します。
3 x 104 個の U87 神経膠腫細胞を 96 ウェル プレートに播種し、12、18、および 36 時間後に、BV2 由来のトキソプラズマ感染エキソソーム (50 μg/mL) または対照として BV2 由来の非パルス エキソソーム (50 μg/mL) と混合しました。 。細胞増殖速度は、Cell Counting Kit-8 (Dojindo、熊本、日本) を使用して測定されました (補足図 S1 〜 S3) 46。
5週齢の雌BALB/cヌードマウスをOrient Bio（城南市、韓国）から購入し、滅菌ケージ内で室温（22±2℃）および湿度（45±15℃）で個別に飼育した。%) 室温 (22±2°C) および湿度 (45±15%) で。12時間の明サイクルと12時間の暗サイクルをSPF（ソウル国立大学医学部動物センター）の下で実施した。マウスをランダムに 5 匹ずつ 3 つのグループに分け、すべてのグループに 1 x 107 個の U87 神経膠腫細胞と増殖因子減少型 BD Matrigel™ (BD Science、マイアミ、フロリダ州、米国) を含む 400 ml の PBS を皮下注射しました。腫瘍注射の 6 日後、BV2 細胞由来のエキソソーム 200 mg (トキソプラズマ感染あり/なし) を腫瘍部位に注射しました。腫瘍感染の２２日後、各群のマウスの腫瘍サイズを週に３回ノギスで測定し、腫瘍体積を式：０．５×（幅）×２×長さによって計算した。
miRCURYTM LNA miRNA アレイ、第 7 世代 has、mmu、および rno アレイ (EXIQON、Vedbaek、デンマーク) を使用したマイクロ RNA 発現解析では、3,100 個のヒト、マウス、およびラット miRNA 捕捉プローブのうち、十分に特徴付けられた 1,119 匹のマウスをカバーしています。この手順中に、子牛腸アルカリホスファターゼで処理し、続いて Hy3 緑色蛍光色素で標識することにより、250 ～ 1000 ng の全 RNA が 5'-リン酸から除去されました。次に、ハイブリダイゼーション チャンバー キット (Agilent Technologies、米国カリフォルニア州サンタクララ) およびハイブリダイゼーション スライド キット (Agilent Technologies) を使用して、マイクロアレイ スライドにロードすることにより、標識サンプルをハイブリダイズさせました。ハイブリダイゼーションを56℃で16時間実施し、その後マイクロアレイを製造業者の推奨に従って洗浄した。次いで、処理されたマイクロアレイスライドを、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇ２５６５ＣＡマイクロアレイスキャナシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してスキャンした。スキャンされた画像は、Agilent Feature Extraction ソフトウェア バージョン 10.7.3.1 (Agilent Technologies) を使用してインポートされ、各画像の蛍光強度は、修正された Exiqon プロトコルの対応する GAL ファイルを使用して定量化されました。現在の研究のマイクロアレイ データは、受託番号 GPL32397 で GEO データベースに保管されています。
トキソプラズマに感染した RH 株または ME49 株のミクログリアにおける成熟エキソソーム miRNA の発現プロファイルを、さまざまなネットワーク ツールを使用して分析しました。腫瘍の発生に関連する miRNA は、miRWalk2.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) を使用して同定され、8.0 を超える正規化シグナル強度 (log2) でフィルタリングされて除去されました。miRNA の中で、T. gondii に感染した RH または ME49 株によって変化した miRNA のフィルター分析により、差次的に発現された miRNA は 1.5 倍を超えて変化していることが判明しました。
細胞を、リポフェクタミン 2000 (Invitrogen、米国カリフォルニア州カールズバッド) を使用して、opti-MEM (Gibco、米国カリフォルニア州カールズバッド) の 6 ウェルプレート (3 x 105 細胞/ウェル) に播種しました。トランスフェクトされた細胞を6時間培養し、その後培地を新鮮な完全培地に交換した。トランスフェクションの24時間後に細胞を回収しました。
統計分析は主に Excel ソフトウェア (Microsoft、ワシントン DC、米国) を使用した Student の t 検定を使用して実行されました。実験動物分析では、Prism 3.0 ソフトウェア (GraphPad Software、米国カリフォルニア州ラホーヤ) を使用して二元配置分散分析を実行しました。 P 値 < 0.05 は統計的に有意であるとみなされました。 P 値 < 0.05 は統計的に有意であるとみなされます。 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. P 値 <0.05 は統計的に有意であるとみなされます。 Ｐ値＜０．０５は、理論的意味を有するとみなされる。 P值< 0.05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. P 値 <0.05 は統計的に有意であるとみなされます。
この研究で使用されたすべての実験プロトコールは、ソウル国立大学医学部の治験審査委員会によって承認されました (IRB 番号 SNU-150715-2)。
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
ファーリー、J.ら。2018 年の世界のがん罹患率と死亡率の推定: GLOBOCAN の情報源と方法。解釈。J. ラック 144、1941–1953 (2019)。
Rasheed, S.、Rehman, K.、Akash, MS 脳腫瘍の危険因子とその治療介入についての洞察。 Rasheed, S.、Rehman, K.、Akash, MS 脳腫瘍の危険因子とその治療介入についての洞察。Rashid, S.、Rehman, K.、Akash, MS 脳腫瘍の危険因子と主要な治療介入の総説。 Rasheed, S.、Rehman, K.、Akash, MS は、腫瘍の危険因子とその治療上の対策について深く理解しています。 Rasheed, S.、Rehman, K.、Akash, MS 脳腫瘍の危険因子と治療介入についての深い理解。Rashid, S.、Rehman, K.、Akash, MS 脳腫瘍の危険因子と主要な治療介入の総説。生物医学。薬剤師。143、112119 (2021)。
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コレイア・ダ・コスタ、JM 他住血吸虫、肝吸虫、蠕虫関連癌のカテコール エストロゲン。フロント。中は暑い。5、444 (2014)。